[发明专利]饭豆柠檬酸转运子基因VuMATE及其应用

说明书

技术领域

本发明属于植物基因工程和农作物育种领域，特别涉及一种柠檬酸转运子基因的克隆及一种新型的番茄转基因材料；具体地讲，涉及饭豆(Vigna umbellata)柠檬酸转运子(MATE)基因的克隆及超表达此基因后培育的转基因番茄在酸性土壤上种植铝耐性提高方面的应用。

背景技术

土壤酸度是一个普遍存在于世界范围内的严重农业生产问题，它影响着全世界40％耕地的作物生产^[1]。植物生长在酸性土壤中会遭遇一系列非生物胁迫，如氮、磷、钾等养分的缺乏，干旱，铝和锰的毒害等。而由于铝可迅速损坏根尖从而导致植物对养分和水分吸收的障碍^[2]使得铝毒成为限制酸性土壤作物生产最主要的因子。我国酸性土壤面积达203万km²，主要分布于华南热带、亚热带地区，约占全国耕地面积的21％^[3]。近年来工业的不断发展，环境的日益恶化，酸雨的频繁发生，以及农业生产中肥料的不合理利用都加速了土壤的酸化，因此铝毒已经引起了国内外专家学者的普遍关注。

伴随着人口的增加和可耕地面积的减少，开发利用酸性土壤具有重大的战略意义。针对酸性土壤上的铝毒害问题，传统上，人们往往采用施石灰和肥料等农艺措施进行改良以提高土壤的pH降低Al的活度。施用石灰和肥料虽能减轻或防治表土的铝毒害问题，但对于心底层土壤施用石灰或肥料既有困难也不经济，而且这些措施需要投入大量的人力、物力和财力，长期施用还会破坏土壤结构，使Zn、Fe等微量元素的生物有效性降低，难以取得良好的经济效益和生态效益。因此，在改土施肥的同时，还须考虑植物的因素，一是充分挖掘植物潜力，筛选天然存在的耐铝的优质种质资源；二是通过遗传改良来获得抗铝毒能力较强的植物品种；这是持续、高效地解决酸性土壤铝毒害的有效途径^[4]，有利于农业的可持续发展。通过遗传改良的方法获得耐铝的转基因品种近年来得到人们的重视，其根本实现途径在于研究耐铝植物的分子生物学机理，克隆耐铝的关键基因，通过基因工程的手段获得高效耐铝的转基因植物。

目前铝胁迫下植物根系有机酸的分泌是大多数植物最重要也是研究最为透彻的耐铝机里^[5，6]，早在1991年，Miyasaka等就发现了铝能诱导有机酸分泌的现象^[7]。有机酸是一种低分子量的碳氢氧化合物，因携带有一个或多个羧基功能团易和金属发生螯合作用，其本身的特性在植物或微生物对营养元素的吸收和代谢、植物对金属的解毒等方面起着不可替代的作用^[8]。耐铝植物在铝胁迫条件下会分泌大量的有机酸，分泌到质外体的有机酸能有效螯合Al³⁺，转变为对植物无毒害的络合物的稳定形态，滞留在外质体中。因此基因工程手段提高耐铝性的工作主要集中在两个方面：一是转入有机酸合成代谢有关的基因，但这些基因的转入在一部分植物中并不能提高铝耐性，有报道指出植物体内有机酸的含量与植物对铝的耐受程度无关；二是转入负责有机酸分泌的基因，这方面的工作常常得到预期的效果。

在耐铝中起重要作用的有机酸主要有苹果酸、柠檬酸和草酸。第一个克隆到的负责Al胁迫条件下有机酸分泌的基因是小麦中的苹果酸转运子TaALMT1^[9]，将其过量表达于大麦中使转基因大麦获得了分泌苹果酸的能力，显示了更高水平的铝耐性^[10]。随后，苹果酸转运子的同源克隆发现了拟南芥中的AtALMT1^[11]和油菜中的BnALMT1和BnALMT2^[12]，缺失AtALMT1的拟南芥突变体分泌更少的苹果酸，对铝毒害也更加敏感。把BnALMT1和BnALMT2转到烟草悬浮细胞中使其在铝胁迫下分泌苹果酸并提高耐铝性。柠檬酸在结合Al³⁺的能力方面大于其它有机酸，具有更高的解铝毒的能力。最近铝激活的柠檬酸转运子基因也先后从高梁(SbMATE)和大麦(HvMATE)中克隆，它们属于MATE(multidrug and toxic compound extrusion)蛋白家族，将SbMATE转入小麦或HvMATE转入烟草都使柠檬酸分泌量和铝耐性得到大幅度提^[13，14]。随后在拟南芥(AtMATE)和玉米(ZmMATE1)中也发现了MATE的同源基因。它们在耐铝性中也发挥重要作用，其中ZmMATE1与耐铝的QTL共定位^[15，16]。可见，定位于细胞膜上的有机酸转运子是控制有机酸分泌和铝耐性的关键因子。

上述参考文献具体如下：