[发明专利]用于检测猪肺炎支原体的LAMP试剂盒及其制备方法

权利要求书

1.一种用于检测猪肺炎支原体的LAMP试剂盒，其特征包含如下组分：

(1)LAMP反应液：

每24μlLAMP反应液中含有：ddH₂O 1.5μL；10×ThermoPol buffer 2.5μL；100mM MgSO₄1.5μl；5M Betaine 2.0μL；2.5mM dNTP 12μL；0.2μM Primer F31μL；0.2μM Primer B31μL；1.6μM Primer FIP 0.5μL；1.6μM Primer BIP 0.5μL；8U/μL Bst酶1.5μL；

(2)排序序列1-4的LAMP引物：

Forward Outer  F3    AGTATTATTGTTGCTAATCCTGT

Reverse Outer  B3    GTTCACCCATCACGTAGG

Forward Inner  FIP   CACTACCGATAACTTTTTGATCGGATGATATAATTACAAGGGCTTACC

Reverse Inner  BIP   GAACTGTTTTAGATACAGCAAGGCTTGAACCGAATTAGGCGATAC

2.用于检测猪肺炎支原体的LAMP试剂盒的制备方法，其特征是包括下述步骤：

(1)从基因数据库检索获得猪肺炎支原体特异性P36基因序列，通过BLAST软件进行同源性分析，获得序列的保守靶部分；

(2)根据步骤(1)所得的保守靶的DNA序列，设计序列1-4的LAMP引物；

(3)根据所得的LAMP的引物配置LAMP反应液，构成检测体系。

3.按权利要求2所述的制备方法，其特征是所述的LAMP反应液是权利要求1所述的24μL LAMP反应液。

4.如权利要求1所述用于检测猪肺炎支原体的LAMP试剂盒的使用方法，其特征是包括以下步骤：

(1)配置上述24μLLAMP反应液；

(2)提取待测样品的核酸；

(3)取1μL所述(2)核酸的提取液，加入步骤(1)配置的LAMP反应液中，使终反应体积为25μL，10000r/min瞬时离心30s以混匀反应液；

(4)置63℃恒温60min进行LAMP扩增，然后80℃2min进行酶的灭活；

(5)取出扩增反应管，根据反应产物的浑浊度初步判断结果；

(6)取5μLLAMP产物进行1.5％琼脂糖电泳；

(7)剩余LAMP产物7000r/min离心5min。

5.如权利要求4所述的使用方法，其中所述步骤(5)所述的结果判断为：浑浊则说明待测样品中存在猪肺炎支原体，澄清透明则说明待测样品中不存在猪肺炎支原体；其中所述步骤(6)所述的结果判断为沉淀则说明待测样品中存在猪肺炎支原体、没有沉淀则说明待测样品中不存在猪肺炎支原体；其中所述步骤(7)所述的结果判断为：梯状条带则说明待测样品中存在猪肺炎支原体，没有梯状条带则说明待测样品中不存在猪肺炎支原体。