[发明专利]用于检测猪肺炎支原体的LAMP试剂盒及其制备方法

说明书

技术领域

本发明属卫生检验领域，涉及一种用于检测猪肺炎支原体的试剂盒，特别涉及一种用于检测猪肺炎支原体的LAMP试剂盒及其建立方法和应用。

技术背景

猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae，Mhp)是引起猪气喘病(MPS)的病原。后者是猪群中流行最广、传播最快、最难净化的疫病之一。猪肺炎支原体通过呼吸道传播，感染呼吸道上皮后导致呼吸道纤毛萎缩、脱落、损坏，上皮细胞坏死，降低呼吸道黏膜的免疫功能，引起肺部功能损伤，容易产生其它呼吸道病原的继发感染。据报道，该病可使猪的饲料转化率降低10％，生长速度降低12％～15％，出栏时间延长1个月，与胸膜肺炎放线杆菌、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环病毒等混合感染时，情况更为严重，该病一旦爆发就难以控制，给养殖业造成巨大的经济损失。

目前对该病致病机理还不十分清楚。在检测方面，国内外已建立了多种血清学检测方法，如免疫琼扩和间接血凝等，但免疫琼扩和间接血凝法存在着灵敏度不高等问题。由于Mhp与非致病支原体之间存在着交叉反应，所以血清学检测方法的研发困难重重。

环介导等温扩增技术(LAMP)是由T.Notomi(2000)发明的一种新型核酸扩增技术，该技术依赖4条特异设计的引物和一种具有链置换特性的DNA聚合酶，在等温条件下可以高效、快速、高特异地扩增靶序列。今年来，国外已将该技术广泛应用于病原体的检测。Masaki Imai等人(2007)利用LAMP建立了禽流感病毒的实验室确诊体系；Nobuyuki Hayashi等人(2007)针对四种香酒酵母的ITS序列设计了LAMP特异性引物，建立了高效的LAMP检测体系。LAMP还可以用于检测其他与人类相关的病毒，如病毒性出血性败血症(VHS)、巨细胞病毒(CMV)、造血组织坏死病毒(IHHNV)、番茄黄化曲叶病毒等。LAMP还可以用于对动物早期胚胎性别鉴定等。目前国内外均未见有用于检测猪肺炎支原体的LAMP试剂盒及在猪肺炎支原体检测中的应用。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用于检测猪肺炎支原体的LAMP试剂盒。

本发明的另一目的在于提供上述LAMP试剂盒的制备方法。

本发明的用于检测猪肺炎支原体的LAMP试剂盒包含如下成分：

(1)LAMP反应液：

每24μl LAMP反应液中含有：ddH₂O1.5μL；10×ThermoPol buffer 2.5μL；100mM MgSO₄1.5μl；5MBetaine2.0μL；2.5mM dNTP 12μL；0.2μM Primer F31μL；0.2μM Primer B31μL；1.6μM Primer FIP 0.5μL；1.6μMPrimerBIP0.5μL；8U/μLBst酶1.5μL；

(2)四条LAMP引物(排序序列1-4)：

Forward Outer  F3   AGTATTATTGTTGCTAATCCTGT

Reverse Outer  B3   GTTCACCCATCACGTAGG

Forward Inner  FIP  CACTACCGATAACTTTTTGATCGGATGATATAATTACAAGGGCTTACC

Reverse Inner  BIP  GAACTGTTTTAGATACAGCAAGGCTTGAACCGAATTAGGCGATAC

本发明的LAMP试剂盒的制备方法通过下述方法和步骤制备(参见附图4)：

1)从基因数据库检索获得猪肺炎支原体基因组序列，通过BLAST软件进行同源性分析，获得P36序列的猪肺炎支原体的特异性的保守靶序列；

2)根据步骤1)所得的保守靶的DNA序列，设计序列1-4的LAMP引物；

3)根据所得的LAMP的引物配置LAMP反应液，构成检测体系。

表1 24μL LAMP反应液的具体配置。

本发明的进一步目的是提供所述试剂盒的应用方法。