[发明专利]SmDXS和SmGGPPS双基因共转化提高丹参酮含量的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体说，是涉及一种利用代谢工程策略，用双关键酶基因共转化提高丹参毛状根丹参酮含量的方法。

背景技术

心脑血管疾病是目前对人类威胁最大的三大类疾病之一，且是位于这三大疾病之首。据统计，全世界每年大约有1700万人死于心脑血管疾病，约占全球总死亡人数的1/3；我国每年大约有260万人死于心脑血管疾病，心脑血管疾病已成为威胁全人类健康与生命的“头号杀手”。因此积极研究及开发高效、低毒和廉价的治疗心脑血管疾病的临床药物对提高人类健康水平具有十分深远的意义。

丹参又名紫丹参、红根、赤参、活血参等，为唇形科鼠尾草属植物丹参(Savia miltiorrhiza Bunge)的干燥根及根茎。丹参作为一种传统中药材在我国沿用已久，始载于《神农本草经》，是一种主治心血管系统疾病的常用中药。丹参药用成分主要包含两类：一类是以丹参酮类化合物为代表的脂溶性二萜类化合物，另一类是水溶性的多聚酚酸类化合物。在临床应用方面，丹参酮类化合物不仅具有天然抗氧化作用、抗动脉粥样硬化、降低心肌耗氧量等心血管药理作用及抗菌消炎作用，而且具有明显的抗肿瘤作用。

由于可以治疗上述多种疾病，丹参在国内外市场上的需求量一直很大；又因为栽培丹参的生长周期长且有效成分含量低，给临床使用和质量控制带来一定困难；另一方面，虽然我国的药用植物资源十分丰富，但传统的中草药提取方法会消耗大量的野生资源，当采集和消耗量超过自然资源的再生能力时，必然会导致物种的濒危甚至灭绝，而且加上自然环境的日益恶化，也进一步导致了药用植物的资源匮乏。因此，如何使得丹参这一原料药材的供应在数量和质量上能更好地满足临床应用的需求成了研究热点。由于丹参的生长周期很长(2年以上)，野生资源的匮乏，而在人工栽培下又面临着种质退化等问题；采用化学合成等方法，又面临着高成本、高污染、工艺流程复杂等问题；而组织培养技术产生的丹参毛状根、再生植株等药用活性成分的积累量还达不到商业开发利用的要求。因此，利用基因工程手段，将丹参酮合成途径中的两个或多个关键酶基因导入丹参中高效表达，获得丹参酮高产的转基因发根或再生植株，再结合离体培养的方法，进行大规模的生产和培养，可望从根本上缩短种植周期、提高丹参药用活性成分和解决丹参的药源问题。

据文献检索分析，1-脱氧木酮糖-5-磷酸合成酶(SmDXS)和牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合酶基因(SmGGPPS)是丹参酮生物合成途径中的两个关键限速酶基因，是丹参酮代谢工程的重要靶点。1-脱氧木酮糖-5-磷酸合成酶(DXS)是1-脱氧-D-木酮糖-5磷酸(DXP)途径中的第一个关键酶，而DXP途径是丹参酮生物合成途径的重要来源之一，因此，SmDXS是丹参酮生物合成途径的关键酶基因。牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶(GGPPS)催化15碳的法呢基焦磷酸(FPP)与另一个5碳分子异戊烯基焦磷酸(IPP)可合成20碳的牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸(GGPP)，GGPP是二萜类物质(包括丹参酮和青蒿素等)的生物合成的关键前体物质。因此，这一步也是利用基因工程技术来调控丹参酮生物合成的关键切入点。采用基因工程手段，将上述的两个关键酶基因SmDXS和SmGGPPS共转化丹参，将打破丹参酮生物合成途径的瓶颈效应，获得高产丹参酮的丹参毛状根或植株，为商业化生产丹参酮提供新型优质药源。因此，本发明在实际解决丹参酮药源紧缺性的问题上具有十分重要的意义。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是克服常规技术中的不足，提供一种有效提高丹参毛状根丹参酮含量的方法。

本发明还提供了实现上述方法的重组载体。

本发明是通过以下技术方案实现，双基因共转化提高丹参酮含量的方法，包括以下步骤：

(1)将1-脱氧木酮糖-5-磷酸合成酶基因(SmDXS基因，GenBank：FJ643618.1)和牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶基因(SmGGPPS基因，GenBank：FJ643617.1)插入植物表达载体，构建重组载体；

所述的1-脱氧木酮糖-5-磷酸合成酶基因和牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶基因序列分别为SEQ ID：1和SEQ ID：2的DNA序列；

植物表达载体可选用pCAMBIA质粒或pBI质粒，尤其是pCAMBIAl304质粒；

(2)将步骤(1)所获得的重组载体转入发根农杆菌，构建含有重组载体的发根农杆菌；发根农杆菌可选用发根农杆菌菌株C58C1、发根农杆菌菌株A4或发根农杆菌菌株L BA9402；