[发明专利]一种测定HMG-CoA还原酶抑制剂浓度的方法

说明书

技术领域

本发明属于酶学和药物化学领域，涉及一种测定HMG-CoA还原酶抑制剂浓度的方法，以及一种测定HMG-CoA还原酶抑制率的方法。

背景技术

HMG-CoA还原酶(3-hydroxy 3-methylglutaryl coenzyme Areductase)是肝细胞合成胆固醇过程中的限速酶，催化生成甲戊二羟酸(Mevalonic Acid，MVA)，抑制HMG-CoA还原酶能够限制胆固醇合成。目前，常见的HMG-CoA还原酶抑制剂有他汀类化合物，例如羟基洛伐他汀酸。

测定HMG-CoA还原酶抑制率的方法可分为酶制备、反应和抑制率检测3个步骤。首先制备大鼠肝微粒体HMG-CoA还原酶液；进而将制备的酶与底物置于缓冲液中，反应一定时间，加酸终止反应；反应终止后，利用酶标仪，直接检测酶反应体系的吸光度或从酶反应体系中分离产物，如甲戊二羟酸内酯(Mevalonolactone，MVAL)，测定其含量。目前对产物(MVAL)含量测定方法有闪烁计数仪测定同位素活度法(Kuroda M，Endo A.Inhibition of in vitro cholesterolsynthesis by fatty acids.Biochim Biophys Acta，1976，486：70；Endo A，et al.Competitive inhibition of 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzymea reductase by ML-236A and ML-236B fungal metabolites，havinghypocholesterolemic acitivity.FEBS Letters，1976，72：323；和AlbertsAW，et al.Mevinolin：a highly potent competitive inhibitor ofhydroxymethylglutaryl-coenzyme A reductase and acholesterol-lowering agent.Proc Natl Acad Sci USA，1980，77(7)：3957)、LC-MS法(Park EJ，et al.Analysis of3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme a reductase inhibitors usingliquid chromatography-electrospray mass spectrometry.JChromatogr B Biomed Sci Appl，2001，754：327)、LC-ESI-MS/MS法(Honda A，Mizokami Y，Matsuzaki Y，et al.Highly sensitive assay ofHMG-CoA reductase activity by LC-ESI-MS/MS.J Lipid Res，2007，48：1212)。

上述方法中，利用酶标仪的分光光度法的不足之处是酶反应体系较复杂并干扰较多，所以不能准确反映某一底物(NADPH)的吸光度并只能定性。产物(MVAL)的含量测定法中，利用闪烁计数仪测定同位素活度比较早期使用的方法，该方法价格昂贵，并存在同位素的安全性问题；利用LC-MS及LC-ESI-MS/MS方法先进及灵敏度较高，但是LC-MS是一级分裂的Mass，所以灵敏度不如二级分裂的LC-MS/MS，LC-ESI-MS/MS是对易于离子化的化合物很有效，但不易离子化的化合物(试验发现他汀类化合物普遍不易离子化)，从而不能正确反映其含量。

血脂康胶囊是以红曲为主要成分的治疗高血脂症的药物，其包含多种HMG-CoA还原酶抑制剂成分(Ma J，Li Y，Ye Q，et al.Constituents of Red Yeast Rice，a Traditional Chinese food andmedicine.J Agric Food Chem.2000，48：5220)，但是由于其中很多成分是未知的，因此难以测定血脂康胶囊中HMG-CoA还原酶抑制剂的含量。

因此，本领域亟需精确测定HMG-CoA还原酶抑制率的方法，以及能够测定未知样品中HMG-CoA还原酶抑制剂浓度的方法。

发明内容

本发明人经过大量的试验和创造性的劳动，惊奇地发现了一种测定HMG-CoA还原酶抑制率的方法，并且结合该方法，能够有效并且精确地测定未知具体成分的样品(例如血脂康胶囊)中HMG-CoA还原酶抑制剂的浓度或者含量。由此提供了下述发明：