[发明专利]存活素酶联免疫试剂盒及其应用

说明书

技术领域

本发明属于生物检测领域，具体涉及一种Survivin酶联免疫试剂盒及其在膀胱癌患者尿Survivin检测中的应用。

背景技术

膀胱癌是国内泌尿系统中最常见恶性肿瘤，90％以上为移行上皮癌，其中约70％为表浅性，20％为浸润性，早期诊断较困难，5％确诊时已发生转移。膀胱癌诊治后容易复发，且复发肿瘤恶性度增加，故治疗后需终身严密的随访。

目前膀胱镜检查及可疑病变处活检仍是膀胱癌诊断和随访的金标准。但是膀胱镜检查会带给患者创伤且检测费用昂贵，同时细胞学检查敏感性低，尽管其特异性能到达94％而相应的敏感性只有35％。细胞学检测的低灵敏性与膀胱镜检的侵入性使得人们对一些非浸入性诊断方法产生了较大兴趣。在过去的的几十年，生物标志物的发展给我们带来了一些新的膀胱癌检测与随访的方法。

Survivin是1997年Altieri等在研究效应细胞蛋白酶受体-1(effector cell protease receptor-1，EPR-1)cDNA，在人类基因组库中筛选克隆时首先被发现，因其具有强大的抗细胞凋亡功能，被命名为“存活素或生存素”。

Survivin作为一种新型的肿瘤标志物，有报道在膀胱癌的诊断中有比较好的敏感性与特异性，但未完全证实。

目前对Survivin检测方法主要有RT-PCR，Real-time PCR及酶联免疫(ELISA)。RT-PCR虽然灵敏，但容易污染。它只是一种定性的检测，且操作繁琐。Real-time PCR采用独特封闭反应，减少了污染，可靠性高，且操作时间短，但该检测的设备与试剂昂贵限制了它的使用与普及。ELISA以抗体包被微孔板的形式，具有灵敏度高，费用低，大通量，在肿瘤标志物的检测中使用比较常见。

发明内容

为了解决上述问题，本发明的目的在于提供一种存活素(Survivin)单克隆抗体，酶联免疫试剂盒及其在膀胱癌尿检中的应用。

本发明提供的存活素单克隆抗体是由杂交瘤细胞株BCHJYS10产生的，是通过大肠杆菌制备的Survivin蛋白，再用纯化的蛋白作为免疫原免疫Balb/c小鼠，然后筛选出的杂交瘤细胞株。本发明提供的杂交瘤细胞株BCHJYS10，已于2011年01月29号在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区大屯路甲3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)保藏，保藏号为CGMCCNo.4574。

本发明还提供含有所述的杂交瘤细胞株BCHJYS10产生的单克隆抗体或生物素标记的所述的单克隆抗体的Survivin酶联免疫试剂盒。

本发明提供的Survivin的酶联免疫试剂盒，它还包括：酶标板、存活素标准品、酶标二抗或酶标亲和素、存活素多克隆抗体或生物素标记的多克隆抗体、底物显色液、终止液、洗涤液、稀释液；其中，包被酶标板所用的缓冲液为0.02～0.05mol/L的碳酸缓冲液，pH值为9.1～9.9；所用的封闭液为含有1～100mg/ml脱脂奶粉的PBS溶液。

本发明所述的试剂盒中特异性抗体为Survivin单克隆抗体或多克隆抗体，浓度为0.1～20μg/ml，优选为1～5μg/ml；生物素标记的Survivin单克隆抗体或多克隆抗体的浓度为0.1～20μg/ml，优选为1～5μg/ml。

本发明所述的试剂盒中，用于标记的生物素与单克隆抗体或多克隆抗体按质量比1∶1～4结合，优选为1∶2。

本发明所述的试剂盒中生物素标记的抗体是按照如下方式制备的：

1)将NHS-Biotin(N-羟基丁二酰亚胺酯化生物素)5mg溶于0.5ml DMSO中，最终浓度为10mg/ml；

2)浓度在1mg/ml以上的单抗或多抗，标记前在碳酸盐缓冲液(0.1mol/L，pH8.2-8.6)中充分透析。4℃1-2h，1L碳酸缓冲液，可搅拌；

3)biotin与单抗或多抗的质量比为1∶2，即1mg单抗或多抗加入500μg的生物素酯(NHS-Biotin-DMSO液50μl)混匀后，室温避光旋转混匀4小时；

4)以PBS充分透析除去游离生物素，标记抗体冻存。

本发明所述的试剂盒，当Survivin单抗作为包被抗体时，Survivin多抗或生物素标记的Survivin多抗作为捕获抗体；当Survivin多抗作为包被抗体时，Survivin单抗或生物素标记的Survivin单抗作为捕获抗体。