[发明专利]NAT2基因扩增用引物对、含有其的NAT2基因扩增用试剂及其用途

说明书

本申请是分案申请，其原申请的国际申请号是PCT/JP2007/073204，中国国家申请号是200780027648.6，申请日为2007年11月30日，发明名称为“NAT2基因扩增用引物对、含有其的NAT2基因扩增用试剂及其用途”。 

技术领域

本发明涉及用于扩增NAT2基因的引物对、含有其的NAT2基因扩增用试剂及其用途。

背景技术

N-乙酰基转移酶(NATs)是与利用N-结合将芳香族胺或杂环胺的芳胺代谢成无毒且稳定的物质的代谢途径有关的酶。其中，NATs亚型中的NAT2关系到异烟肼(INH)、磺胺二甲嘧啶、其它的磺胺类、普鲁卡因胺、肼酞嗪、咖啡因、氨苯砜等同素环和杂环芳胺、胼样药物的解毒过程及2-氨基芴、4-氨基联苯、联苯胺、β-萘胺、蛋白质的热分解物质中存在的杂环芳胺等表达性生理物质、环境物质等的活化。已知NAT2显示多态性，在人体中有19种多态性。这些多态性中，NAT2*5类(NAT2*5A～5D)为NAT2基因的mRNA中的341位的T(胸腺嘧啶)突变成C(胞嘧啶)的多态性，NAT2*6类(NAT2*6A、NAT2*6B)为上述mRNA中的590位的G(鸟嘌呤)突变成A(腺嘌呤)的多态性，NAT2*7类(NAT2*7A、NAT2*7B)为mRNA中的857位的G(鸟嘌呤)突变成A(腺嘌呤)的多态性。

已知具有这些突变的患者在服用作为抗拮抗剂的INH时，会发生肝功能损伤。其原因在于，由于NAT2基因突变，NAT2活性改变，由此无法充分地进行INH的N-乙酰化，肝毒性高的肼的产生增多。另外，还已知NAT2的基因多态性与上述普鲁卡因胺或柳氮磺胺吡啶等的副作用有关。因此，确认患者 NAT2基因多态性在回避副作用、进行适当药物治疗时极为重要。特别是，对于NAT2而言，重要的是确认多个多态性(NAT2*5、NAT2*6、NAT2*7)。

另外，作为在基因水平解析所有疾病的原因、个体间的疾病易感性(易患疾病)、个体间的药效不同等的方法，广泛地进行点突变、所谓的单核苷酸多态性(SNP)的检测。点突变的通常检测方法可以举出(1)对于试样的目标DNA利用PCR(聚合物酶链反应)将相当于检测对象序列的区域扩增、对其全基因序列进行解析的直接测序法；(2)对于试样的目标DNA，利用PCR将相当于检测对象序列的区域扩增，通过随着上述检测对象序列中有无目标突变而剪切作用不同的限制酶将该扩增产物切断，进行电泳从而进行分型的RFLP解析；(3)使用目标突变位于3’末端区域的引物进行PCR，通过有无扩增来判断突变的ASP-PCR法等。

但是，这些方法例如必须进行由试样提取的DNA的精制、电泳、限制酶处理等，因此需要功夫和成本。另外，进行PCR后，有必要暂时开启反应容器，因此有上述扩增产物混入到之后的反应体系内，解析精度降低的顾虑。而且，由于自动化困难，因此无法解析大量的样品。另外，对于上述(3)的A SP-PCR法，还存在特异性低的问题。

由该问题出发，近年来作为点突变的检测方法，正在实施对由目标核酸和探针形成的双链核酸的融解温度(Tm)进行解析的方法。这种方法由于通过例如Tm解析或上述双链的融解曲线的解析来进行，因此称作融解曲线解析。其为以下的方法。即，首先使用与含有检测目标的点突变的检测对象序列互补的探针，使检测试样中的目标单链DNA与上述探针形成杂交体(双链DNA)。接着，对该杂交产物实施加热处理，通过吸光 度等信号的变动来检测伴随温度上升的杂交体的解离(融解)。然后，根据该检测结果确定Tm值，从而判断有无点突变。在杂交产物的同源性越高时Tm值越高、同源性越低时Tm值越低。因此，对于含有点突变的检测对象序列和与其互补的探针的杂交产物，预先求得Tm值(评价标准值)，再测定检测试样的目标单链DNA和上述探针的Tm值(测定值)。上述测定值与评价标准值相同时，则可以判断为匹配、即目标DNA中存在点突变，测定值低于评价标准值时，则可以判断为不匹配、即在目标DNA上不存在点突变。而且，通过该方法还可以使基因解析自动化。