[发明专利]产谷氨酰胺转氨酶的基因工程菌及其构建方法

说明书

技术领域

本发明属于基因工程领域，涉及基因工程菌株及其构建方法，尤其是一种产谷氨酰胺转氨酶的基因工程菌及其构建方法。

背景技术

谷氨酰胺转氨酶是一种可以催化转酰基反应，能够使蛋白质(或多肽)之间发生共价交联，交联后可使改变蛋白质具有一些特性，具体包括：1、使蛋白质改性，改性后的蛋白质其塑性、持水性、水溶性和功能性得到改善；2、保护食品中的赖氨酸免受各种化学反应的破坏；3、可用于包埋脂类或脂溶性物质；4、可以形成耐热、耐水性的膜；在形成凝胶过程中不需要热处理；5、通过将包含各种必需氨基酸的蛋白质之间交联，提高蛋白质的营养价值。目前，转谷氨酰胺酶已应用于肉制品、鱼肉制品、乳制品、植物蛋白制品、焙烤制品、固定化酶以及可食性包装中。

利用工程菌生产谷氨酰胺转氨酶是现在研究的热点，特别是用大肠杆菌和谷草芽孢杆菌这两个较为成熟的表达体系，但由于谷氨酰胺转氨酶在大肠杆菌中大部分以包涵体的形式表达出来，后续的复性过程较为复杂且费用较高，对大规模工业化生产有一定的局限性。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足之处，提供一种产谷氨酰胺转氨酶的基因工程菌及其构建方法，构建的工程菌株增加了谷氨酰胺转氨酶基因的拷贝数，有效提高酶的表达量。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

一种产谷氨酰胺转氨酶的基因工程菌，宿主菌为枯草芽孢杆菌，包含重组质粒pWB980-tg。

而且，所述重组质粒pWB980-tg中的tg大小为谷氨酰胺转氨酶基因大小为738bp，其序列为序列3。

而且，所述重组质粒pWB980-tg中的tg的来源为枯草芽孢杆菌。

而且，所述重组质粒pWB980-tg具有表达该基因所需的控制元件，含有一个启动子和一个终止子，在启动子和终止子之间有一段多克隆位点，这些多克隆位点分别包含有若干单一酶切位点。

一种产谷氨酰胺转氨酶的基因工程菌的构建方法，构建方法包括如下步骤：

(1)根据GenBank中已报道的枯草芽孢杆菌谷氨酰胺转氨酶基因为依据，设计引物，引物序列为序列1和序列2，利用PCR得到谷氨酰胺转氨酶基因tg；

(2)表达载体的构建：将步骤(1)得到的目的基因酶切后与表达载体pWB980连接，鉴定正确后，获得重组质粒为pWB980-tg；

(3)转化和表达：重组质粒pWB980-tg转化表达宿主枯草芽孢杆菌中，构建基因工程菌，鉴定正确后即为产谷氨酰胺转氨酶的基因工程菌。

而且，所述表达载体pWB980来源于携带质粒pWB980的枯草芽孢杆菌菌株。

而且，所述重组质粒pWB980-tg中的tg大小为谷氨酰胺转氨酶基因大小为738bp，其序列为序列3。

而且，所述表达载体pWB980-tg中的tg的来源为枯草芽孢杆菌。

本发明的积极效果：

1、本发明以工业化枯草芽孢杆菌为基础，采用基因工程重组技术构建DB104/pWB980基因工程菌株，构建的工程菌株增加了谷氨酰胺转氨酶基因的拷贝数，有效提高酶的表达量，达到谷氨酰胺转氨酶大量合成，工程菌发酵液酶活达2U/ml，为进一步批量生产谷氨酰胺转氨酶提供有效的途径，打破大量生产谷氨酰胺转氨酶纯化费用昂贵的瓶颈，符合当前生物药物领域发展趋势，不仅具有较强的基础理论研究价值，而且具有巨大的经济效益和社会效益，市场开发前景广阔。

2、本发明运用发酵工程技术将DB104/pWB980基因工程菌株进行发酵，得到了一个基因工程菌的最适发酵条件，不仅得率高，还可以节约工业用料，具有明显社会效益。

附图说明：

图1为本发明的扩增电泳图，其中：1、PCR获得的谷氨酰胺转氨酶基因；2、1kb DNAMarker；

图2为本发明pWB980-tg的重组表达质粒的结构图；

图3为本发明表达蛋白的SDS-PAGE分析；

图4为本发明构建基因工程菌株及其利用该菌株发酵生产谷氨酰胺转氨酶的流程图。

具体实施方式

下面结合实施例，对本发明进一步说明，下述实施例是说明性的，不是限定性的，不能以下述实施例来限定本发明的保护范围。