[发明专利]用于检测水稻白叶枯病菌的引物、方法以及试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及一种用于检测水稻白叶枯病菌的引物、方法以及试剂盒，具体涉及一种用于检测水稻白叶枯病菌强毒菌株GD414的引物、方法以及试剂盒。

背景技术

按照在一套水稻近等基因系上的反应型，可以将中国水稻白叶枯病菌划分成9个标准生理小种，其中GD414是R3号小种的典型代表，是我国发现的一株水稻白叶枯病菌强毒菌株。因为各水稻品种对各水稻白叶枯病菌小种的抗性不一样，因此鉴定各地区的流行小种对水稻种植品种的选择将具有指导意义。GD414作为一个典型小种的代表，在中国南方稻区经常作为优势小种出现，因此鉴定GD414将具有更重要的意义和作用。

传统的鉴定方法是通过菌株在6个水稻近等基因系材料上的抗病反应模型来判断，这种方法需时较长，工作繁琐且精确度较低。分子水平鉴定方法比传统的寄主反应方法更简单、快速，并且节约空间和劳动力。

发明内容

因此，本发明的目的是提供一种用于检测水稻白叶枯病菌强毒菌株GD414的引物、方法以及试剂盒，利用所述引物、方法以及试剂盒能够准确、简便、迅速地将GD414与其它白叶枯病菌菌株区分开来，从而为水稻种植品种的选择提供必要的指导。

用于实现上述目的的技术方案如下：

一种用于检测水稻白叶枯病菌菌株GD414的引物，该引物的上游引物核苷酸序列为SEQ ID NO：4，下游引物核苷酸序列为SEQ ID NO：3。

一种用于检测水稻白叶枯病菌菌株GD414的方法，该方法包括以下步骤：

(1)挑取待测菌株菌落或提取待测菌株基因组DNA作为PCR扩增模板，采用上述引物进行PCR扩增；

(2)对PCR扩增的产物进行琼脂糖凝胶电泳分析。

在上述方法中，挑取待测菌株菌落作为PCR扩增模板时，PCR扩增的条件为94℃下变性5分钟；94℃下变性30秒，58℃下退火30秒，72℃下延伸1分钟，30-35个循环；72℃延伸10分钟。

在上述方法中，提取待测菌株基因组DNA作为PCR扩增模板时，PCR扩增的条件为94℃下变性3分钟；94℃下变性30秒，58℃下退火30秒，72℃下延伸1分钟，30-35个循环；72℃延伸10分钟。

PCR反应体系为20μl反应体系，包括：10×PCR缓冲液2μL，dNTP(各2.5mM)1μL，引物(10μM)各1μL，Taq酶1U，待测菌株基因组DNA 10ng，补ddH₂O至反应总体积为20μL。其中10×PCR缓冲液成分如下：200mMTris-HCl(pH 8.4)，200mM KCl，100mM(NH₄)₂SO₄，15mM MgCl₂。

在上述方法中，琼脂糖凝胶的浓度为0.8-2％(g/ml)，琼脂糖凝胶电泳的电压为4-6v/cm，水稻白叶枯病菌菌株GD414的琼脂糖凝胶电泳特异性条带出现在985bp处。

一种用于检测水稻白叶枯病菌菌株GD414的试剂盒，该试剂盒包含上述引物。优选地，所述试剂盒还包括Taq酶，dNTP，10×PCR缓冲液。其中10×PCR缓冲液成分如下：200mM Tris-HCl(pH 8.4)，200mM KCl，100mM(NH₄)₂SO₄，15mM MgCl₂。

本发明利用生物信息和生物学知识，通过一系列实验筛选，发现了GD414菌株基因组所具有的与其它白叶枯病菌菌株所不同的特异性位点，并利用这一特异位点设计并筛选出相应的引物、PCR检测方法以及相应的检测试剂盒，从而将GD414与其它白叶枯病菌菌株准确、简便、迅速地区分开来。实验结果表明，采用琼脂糖凝胶电泳分析时，水稻白叶枯病菌菌株GD414的特异性条带出现在985bp处，非常易于辨认区分，表明上述引物、方法以及试剂盒明显更有利于水稻白叶枯病菌菌株GD414鉴定。

附图说明

以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：

图1显示实施例1中采用初始引物对水稻白叶枯病菌标准生理小种菌株多态性的检测结果；

图2显示实施例1中采用GD414(4)引物对水稻白叶枯病菌标准生理小种菌株检测的结果；

图3显示实施例1中采用GD414(5)引物，即本发明的特异性引物对水稻白叶枯病菌标准生理小种菌株检测的结果；