[发明专利]检测Thl/Th2细胞因子核糖核酸的相对定量试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术，是一种基于聚合酶链反应(PCR)的分子生物学方法，特别是涉及荧光定量的聚合酶链反应(Q-PCR)。通过检测多个免疫相关分子的mRNA的相对含量反映个体的T细胞免疫状态。在合成cDNA的引物中其3’端引入11个特异性核苷酸序列可以逆转录mRNA，并在5’端带一个高质量的核苷酸序列作为标签(亦是引物位置)与对侧基因特异性引物进行Q-PCR对各种mRNA进行扩增和相对定量。在与GAPDH的含量进行比较后，得出各种mRNA的相对含量。IL-2、INF-γ、IL-12、IL-4、IL-10、TGF-b1 mRNA的相对含量可反映个体T细胞免疫状态，特别是Th1/Th2细胞的平衡。此方法可一次性对多个基因表达进行相对定量，对个体T细胞免疫状态进行评估，而且可以通过分选技术对不同的T细胞类型进行分析，达到更准确的评估效果。优化实验条件后，构建简单、准确的相对定量检测试剂盒。

背景技术

mRNAs是普遍存在于人体内的核苷酸，其表达受到各种因素的调节。mRNA的含量对蛋白质的合成有重要的作用。通过定量mRNA可以反映蛋白质的合成，间接反映表现各种蛋白质的生物学功能。mRNAs的差异性表达在细胞发育、肿瘤的发生、疾病进展等重要的生理、病理过程发挥了重要的作用。静止与激活的T细胞中mRNAs表达谱和丰度也不同，表现出显著的表达差异。而且不同类型的T细胞mRNAs表达也存在显著的差异，其在T细胞的发育、免疫性疾病进展、免疫抑制等生理、病理过程中发挥了重要的影响和作用。T细胞内mRNAs的检测有可能成为诊断、治疗和预后判断的靶分子，在研究恶性肿瘤、免疫性疾病和病原体感染等常见疾病的免疫病理过程和分子机制中有突出的研究价值。

评价个体免疫状态主要依赖以T细胞功能检测为基本的生物技术，但是目前各种检测方法都有明显缺陷，临床实验室主要通过检测淋巴细胞的比例来完成，突出的缺陷是不能反映老年人、免疫抑制药物治疗患者的免疫状态。国外开发出一种immunknow的检测方法，主要检测T细胞受刺激后ATP生成数量来评价免疫抑制治疗患者的免疫抑制程度，需要花费时间15-18小时的体外培养，而且需要特殊的仪器设备检测细胞ATP含量。总体来说，T细胞功能检测存在实验时间长、无法标准化、需要特殊仪器、价格昂贵等情况。通过建立开放的荧光定量PCR技术平台，结合创新的mRNA检测方案，开发全新的检测方法。此方法依靠PCR技术的高灵敏性和荧光定量的效果，可以检测不同状态T细胞的mRNA表达量。同时T细胞受刺激后mRNA可以在细胞内快速生成，对T细胞内Th1/Th2 分泌的细胞因子的定量，可以反映整体免疫状态，并可通过荧光定量PCR进行量化评分达到评价免疫状态的效果。

T细胞作为评价免疫状态的关键细胞，是各种免疫评价指标检测的主要对象。通过全血培养系统可以明显缩短标本处理时间，在刺激培养的时间内，通过磁珠阳选CD4+的T细胞，快速分离目的细胞并完成总RNA或短片段RNA的提取，并于荧光PCR仪器上进行检测。总结以上过程可以发现此方法可以有效的缩短实验时间、减少经济费用，试剂和仪器可开放使用。对个体免疫功能研究依赖快速、准确、简单的筛选技术和定量检测技术。但是涉及Th1/Th2的细胞因子种类多，而且存在网络性的相互作用，通过此发明可以使多种mRNA的检测标准化，使本来很难采用统一常规技术检测的一组核糖核酸可以通过标准化的核酸核酸扩增技术进行表达差异分析和定量检测。通过芯片技术可以区分拷贝数大的mRNAs表达差异，但是需要大量的标本提取RNA。Q-PCR技术可以定量检测低拷贝的核酸片段，首先通过带标签的引物对所有带多聚腺嘌呤的mRNA进行逆转录成cDNA，再通过Q-PCR进行相对定量。

目前，还未开发出准确、快速、简单、费用低廉的个体免疫状态评价技术。本发明基于Q-PCR技术，通过带标签的引物3’端引入11个胸腺嘧啶的核苷酸，可以逆转录几乎所有mRNA，并通过一套特异性引物进行Q-PCR分析，进行相对定量的检测，解决目前个体免疫状态评价的技术瓶颈。

发明内容