[发明专利]一种甲型H1亚型流感病毒双抗体夹心ELISA试剂盒及应用

说明书

技术领域

本发明涉及动物病毒学与动物传染病学检测技术领域。具体地说，本发明涉及一种甲型H1亚型流感病毒双抗体夹心ELISA检测试剂盒及其在猪群中甲型H1亚型流感病毒抗原检测的应用。

背景技术

1975年，Kohler G和Milstein C在Nature杂志上发表了细胞融合法建立杂交瘤技术，创建了具有划时代意义的杂交瘤单克隆抗体技术。经克隆后产生结构和各种特性完全相同的高纯度抗体，称为单克隆抗体(Monoclonal Antibody，McAb)，简称单抗。单克隆抗体技术的发现和使用，对现代生命科学研究的发展起到了巨大的推动作用，已经成为生物技术领域的一个重要方面。迄今，该技术的应用已经广泛应用于基础研究、疾病诊断、治疗、预防等方面。

2009年6月世界卫生组织宣布对甲型(H1N1)流感的警戒级别升至6级，意味着甲型(H1N1)流感的世界性大流行已形成。最近一次流感的世界性大流行起源于墨西哥，一开始被称为猪流感(Swine flu)，后根据病毒的分析，改称为猪源性流感病毒感染(swine origin influenza virus infection，简称S-OIV infection)，最后为了与人的季节性流感A(H1N1)区别，改称新流感A(H1N1)，在我国则称为甲型H1N1流感。甲型H1N1流感对人及动物的健康造成巨大的影响，而且对经济造成了巨大的损失。

1971年瑞典的Engvall等人分别以纤维素和聚丙乙烯试管作为固相载体吸附抗原/抗体，建立了酶联免疫吸附法(Enzyme Linked ImmunosrbentAssay，简称ELISA方法)。1974年Voller等人改用聚苯乙烯微量反应板作为固相免疫吸附载体，使ELISA方法得以推广应用，使得用于抗原定位的酶标记抗体技术发展成为液体标本中微量物质的测定方法，并逐渐成为抗原抗体检测中最为常用的一种方法。它将酶标记物同抗原抗体复合物的免疫反应与酶的催化放大作用相结合，既保持了酶催化反应的敏感性，又保持了抗原抗体反应的特异性，因而极大的提高了灵敏度。同时它又是一种非均相免疫分析方法，即在反应的每一步都有洗涤过程，从而除去了未反应物和干扰物质。由于ELISA方法具有灵敏度高、特异性强、操作简便、检测迅速和非放射性以及可以批量测定等诸多优点，使得ELISA方法得到了越来越广泛的应用。(焦奎等.酶联免疫分析技术及应用[M].北京：化学工业出版社，2004，84～141；李文敏.酶联免疫吸附反应的技术进展及应用[J].湖北职业技术学院学报，2003，4(6)：65～69)

酶标记抗体技术是ELISA检测方法的关键技术，本发明中所用的酶标记抗体是本实验室自行生产抗甲型H1亚型流感病毒血凝素单克隆抗体，经过辣根过氧化物酶(简称HRP)标记，具有很高的酶活性，产量高及成本低。

发明内容

本发的的主要目的在于克服现有技术的缺陷，提供一种甲型H1亚型流感病毒双抗体夹心ELISA检测试剂盒，以解决猪群中甲型H1亚型流感病毒抗原的检测。

本发明的第一个目的是得到一种特异性强的可用于组装ELISA试剂盒的核心试剂的抗甲型H1亚型流感病毒血凝素蛋白的单克隆抗体。

本发明的第二个目的是建立一种甲型H1亚型流感病毒的双抗体夹心ELISA检测方法

本发明的第三个目的是组装一种甲型H1亚型流感病毒的双抗体夹心ELISA检测试剂盒。

本发明的第四个目的是利用该试剂盒在猪群甲型H1亚型流感病毒抗原检测中的应用。

本发明是这样实现的：

申请人所在的华中农业大学农业微生物国家重点实验室病毒室从猪群中分离得到的一株甲型H1亚型流感病毒A-Influ/JML-F9原毒株，该毒株于2011年1月27日送交湖北省武汉市武汉大学内的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏编号为CCTCC NO：V201105。

申请人制备了一种特异性强的单克隆抗体，它是抗甲型H1亚型流感病毒血凝素(HA)蛋白的单克隆抗体，分泌该单克隆抗体的杂交瘤细胞株5F7，于2011年1月27日送交湖北省武汉市武汉大学内的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏编号为CCTCC NO：C201106。

申请人利用所述的单克隆抗体制备成双抗体夹心ELISA核心试剂，组装了一种用于快速检测适用于猪群的甲型H1亚型流感病毒的双抗体夹心ELISA试剂盒。本发明的试剂盒是由盒体和包含在盒体内的样品稀释液、洗涤液、底物A液、底物B液、终止液，阳性对照样品和阴性对照样品组成。