[发明专利]一种大量个体化天然干扰素诱导方法

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程和医学生物技术领域。具体是一种大量个体化天然干扰素诱导方法。涉及利用PCR技术获得EB病毒的LMP1核苷酸序列，然后利用重叠PCR技术将LMP1的C末端的2个Nco I位点间的495bp的致癌性片段缺失突变，但保持其转化B淋巴细胞为淋巴母细胞的能力。将获得的LMP1缺失突变体克隆入腺病毒载体，感染患者外周血淋巴细胞，再利用仙台病毒诱导，产生大量个体化的天然干扰素，应用于患者，能高效发挥其抗肿瘤、抗病毒作用，同时避免了基因工程干扰素产生的副作用。

发明背景

干扰素（Interferon，IFN） 是1957 年Issac 和Linderman在研究病毒间干扰现象时发现的，是一种由病毒感染诱导产生的，具有抗病毒作用的细胞因子[1]。它可以与细胞膜上的特异性受体结合，诱导产生特异性蛋白质和酶，从而抑制病毒增殖；它可使肿瘤细胞溶解并改变肿瘤细胞表面的标志，使之容易被免疫细胞识认并消灭[2]；也能增强B细胞、T细胞活性，促进吞噬细胞的吞噬作用，增强机体免疫应答能力[3]。干扰素的受体分布广泛，几乎所有的有核细胞表面都存在，因此干扰素的作用范围非常广泛[4]。

根据产生细胞、受体和活性等将干扰素分为I型、Ⅱ型两种类型。Ⅰ型IFN家族主要包括IFN-α、IFN-β，同时包括亚家族成员IFN-κ、IFN-ε、IFN-ω等。Ⅱ型IFN家族只有IFN-γ[5]。Ⅰ型IFN家族位于人染色体9号短臂，一些刺激因素如病毒、细菌和某些化学合成物质等能够刺激淋巴细胞以及体细胞产生Ⅰ型IFN，发挥其抑制病毒复制、抑制肿瘤细胞增殖、抗原修饰及免疫修饰等生物学作用[6,7]。Ⅱ型IFN位于人12号染色体，除了在免疫缺陷型疾病中发挥作用，也和慢性炎症和自体免疫性疾病有密切联系[8]。

按生产途径，将用人血淋巴细胞生产的干扰素称为天然干扰素，用基因重组技术生产的称为重组干扰素。天然干扰素需要培养人外周血淋巴细胞，用病毒诱导干扰索分泌，然后离心、分离获得上清液，再经过纯化制得。这种方法得到的干扰素具有天然的分子结构和生物活性，但是生成效率较低且成本太高，难以大规模生产[9]。由于天然干扰素在应用中的限制，20世纪70年代起科学家开始探索的基因工程干扰素生产技术，成为目前产业化大规模生产干扰素的方法，并广泛应用于临床[10]。

与天然干扰素相比，重组干扰素尽管具有纯度高、生成效率高、成本低等优点，但是仍然存在问题。首先，重组干扰素的疗效较差，例如仅有50%的丙肝患者和10%的黑素瘤患者对其敏感[11]。这是由于干扰素有较严格的种属特异性，外源性的干扰素可刺激机体产生抗体，导致其疗效降低。其次是副作用的产生，最常见的是发热及流感样综合征[12]，这可导致提前终止IFN治疗。研究报道，对一些恶性肿瘤如卡波济肉瘤患者，经IFN治疗产生的副作用比肿瘤对机体的损伤更严重。这也使IFN在临床的应用受到限制[13]。因此，迫切需要寻找一种安全高效获得干扰素的途径，改善和提高干扰素临床应用效果。

EB 病毒( Epstein-Barr virus, EBV) 是一种人类γ疱疹病毒，可转化人外周血单个核细胞（PBMC），形成稳定增生的淋巴母样细胞系（LCLs），在肿瘤的发生发展中具有重要作用[14]。EBV感染可以引发单核细胞增多症，EBV与淋巴瘤、鼻咽癌、白血病及胃癌等恶性肿瘤的发生也有密切关系。

EBV转化的B 淋巴细胞不同程度地表达9个与细胞内病毒潜伏感染有关的病毒蛋白，在这些潜伏蛋白中，膜蛋白1（LMP1）的作用最为重要，是EBV转化B淋巴细胞所必需的，经LMP1转化的淋巴细胞可促进自身增殖[15]。它是一个完整的膜蛋白分子，由胞浆区短N端、跨膜区和胞浆区长C端3个部分组成。胞浆区C端由200个氨基酸组成，其中后155个氨基酸是发生转化功能的基础，前44个氨基酸则维持已转化细胞的生长[16]。

LMP1能够诱导EBV潜伏细胞产生大量干扰素，通过激活干扰素调节因子7（IRF-7），LMP1诱导多种IFN亚型的表达，发挥其生物学作用[17]。虽然利用LMP1转化人外周血细胞，经诱导可产生大量天然干扰素。然而，LMP1也是致癌基因，通过TRAF-TRADD信号传递，活化转录因子NF-κB、AP-1和JNK，从而调节细胞增殖和凋亡，达到细胞的恶性转化。我国刘海鹰等对LMP1进行基因改造，去除了LMP1 C末端的2个Nco I位点间的495bp的LMP1致癌性片段，发现其DNA疫苗可以在Balb/c纯系小鼠产生一定的CTL反应[18]。可见去除致癌性片段仍保留了LMP1的转化功能及免疫原性。