[发明专利]表达mpd基因的玫瑰红红球菌及其构建方法

权利要求书

1.表达mpd基因的玫瑰红红球菌R-D3（Rhodococcus rhodochrous R-D3），其特征在于：其基因核苷酸序列如下：

ATGCCCCTGAAGAACCGCTTGCTGGCCCGCCTGTCCTGTGTTGCGGCCGTGGTGGCCGCCACGGCCGCCGTTGCACCGTTGACGCTGGTGTCCACCGCCCACGCCGCCGCACCGCAGGTGCGCACCTCGGCCCCCGGCTACTACCGGATGCTGCTGGGCGACTTCGAAATCACCGCGCTGTCGGACGGCACGGTGGCGCTGCCGGTCGACAAGCGGCTGAACCAGCCGGCCCCGAAGACGCAGAGCGCGCTGGCCAAGTCCTTCCAGAAAGCGCCGCTCGAAACCTCGGTCACCGGTTACCTCGTCAACACCGGCTCCAAGCTGGTGCTGGTGGACACCGGCGCGGCCGGCCTGTTCGGCCCCACCCTGGGCCGGCTGGCGGCCAACCTCAAGGCCGCAGGCTATCAGCCCGAGCAGGTCGACGAGATCTACATCACCCACATGCACCCCGACCACGTGGGCGGCTTGATGGTGGGTGAGCAACTGGCGTTCCCGAACGCGGTGGTGCGTGCGGACCAGAAAGAAGCCGATTTCTGGCTCAGCCAGACCAACCTCGACAAGGCCCCGGACGACGAGAGCAAAGGCTTCTTCAAAGGCGCCATGGCCTCGCTGAACCCCTATGTGAAGGCCGGCAAGTTCAAGCCTTTCTCGGGGAACACCGACCTGGTGCCCGGCATCAAAGCGCTGGCCAGCCACGGCCACACCCCGGGCCACACCACCTACGTGGTCGAAAGCCAGGGGCAAAAGCTCGCCCTGCTCGGCGACCTGATACTCGTCGCCGCGGTGCAGTTCGACGACCCCAGCGTCACGACCCAGCTCGACAGCGACAGCAAGTCCGTCGCGGTGGAGCGCAAGAAGGCCTTCGCGGATGCCGCCAAGGGCGGCTACCTGATCGCGGCGTCCCACCTGTCGTTCCCCGGCATCGGCCACATCCGCGCCGAAGGCAAGGGCTACCGTTTCGTGCCGGTGAACTACTCGGTCGTCAACCCCAAGTGA。

2.表达mpd基因的玫瑰红红球菌R-D3（Rhodococcus rhodochrous R-D3）的构建方法，其特征在于包括以下操作步骤：

2.1 提取微嗜酸寡养单胞菌G1（Stenotrophomonas acidaminiphila G1）菌株的基因组DNA；

2.2 以所述基因组DNA为模板PCR扩增微嗜酸寡养单胞菌G1（Stenotrophomonas acidaminiphila G1）菌株的mpd基因，扩增引物序列如下：

正向：5’-GAATTCATATGCCCCTGAAGAAC-3’

反向：5’-GAATTCTCGAGCTTGGGTTGACGACCG-3’

PCR扩增反应参数：

预变性        94℃         5分钟，

变性          94℃         1分钟，

复性          58℃         1分钟，

延伸          72℃         1分钟，

循环          30个，

终止延伸       72℃        10分钟，

得到微嗜酸寡养单胞菌G1菌株的PCR产物，简称为G1菌株的PCR产物；

将G1菌株的PCR产物通过1%琼脂糖电泳检测，回收片段大小1kb的G1菌株的PCR产物；

2.3 将片段大小1kb的G1菌株的PCR产物与大肠杆菌质粒pET-28a(+)连接，构建测序重组质粒pET-C，操作方法如下：

2.3.1 酶切G1菌株的PCR产物

用限制性内切酶XhoⅠ、NdeⅠ酶切片段大小1kb的G1菌株的PCR产物，酶切条件如下：

限制性内切酶XhoⅠ                          0.5uL

限制性内切酶NdeⅠ                          0.5uL

G1菌株的PCR产物                           4uL

10倍的酶切缓冲液（H Buffer）                2 uL

双蒸水（ddH₂O）                              13uL

37℃水浴4小时，加入1/10体积的10倍上样缓冲液（10×Loading Buffer）终止酶反应；得到G1菌株的PCR产物的酶切产物；

2.3.2 回收

将G1菌株的PCR产物的酶切产物通过 1%琼脂糖电泳检测，回收1kb的G1菌株的PCR产物的酶切片段；

2.3.3 酶切大肠杆菌质粒pET-28a(+)

用限制性内切酶XhoⅠ、NdeⅠ酶切pET-28a(+)质粒，酶切条件如下：

限制性内切酶（XhoⅠ）                  0.5uL

限制性内切酶（NdeⅠ）                  0.5uL

大肠杆菌质粒pET-28a(+)                  4uL

10倍的酶切缓冲液（H Buffer）           2 uL

双蒸水（ddH₂O）                         13uL

37℃水浴4h，加入1/10体积的10倍上样缓冲液（10×Loading Buffer）终止酶反应；得到酶切的大肠杆菌质粒pET-28a(+)；

2.3.4 连接

用连接试剂盒试剂将所述1kb的的G1菌株的PCR产物的酶切片段和酶切的大肠杆菌质粒pET-28a(+)连接起来；连接条件如下：

酶切的大肠杆菌质粒pET-28a(+)         1μL   

G1菌株的PCR产物的酶切片段         1μL

双蒸水（ddH₂O）                       3μL

溶液I（Solusion I）                    5μL

冰浴加样，混匀后16℃、30分钟，即为测序重组质粒pET-C连接反应液；

2.3.5大肠杆菌感受态细胞的制备和转化

2.3.5.1 将大肠杆菌DH10B接种于50ml的LB培养基中，温度37℃，摇床培养16小时，得到培养物；

2.3.5.2 取3mL培养物转接于300mL LB培养基中，在温度37℃的摇床上剧烈振荡培养2.5-3小时，使其光密度＝0.4-0.5（OD600=0.4-0.5）；

2.3.5.3 将浓度0.5mmol/L的氯化钙（CaCl₂）溶液置于冰上预冷，分装6支50ml离心管，冰浴5分钟，4℃、1600g离心7分钟；

2.3.5.4 弃去上清，加入7mL预冷浓度0.5mmol/L的氯化钙（CaCl₂）溶液，轻轻悬浮细胞，在冰放置10分钟；4℃下1100g冷冻离心5分钟；

2.3.5.5 弃去上清，加入7mL预冷浓度0.5mmol/L的氯化钙（CaCl₂）溶液，轻轻悬浮细胞，在冰放置30分钟；4℃下1100g冷冻离心5分钟；

2.3.5.6 倾去上清液，加入1.4ml浓度0.5mmol/L的氯化钙（CaCl₂）溶液，其中甘油浓度为10%，悬浮离心后沉淀的细胞，分别取悬浮的细胞100μl分装到1.5ml离心管中，将离心管-70℃保存，即为大肠杆菌DH10B感受态细胞；

2.3.5.7 将10μl所述测序重组质粒pET-C连接反应液加入到100μl大肠杆菌DH10B感受态细胞中；

2.3.5.8 轻轻摇匀，冰上放置10分钟，充分混匀；

2.3.5.9 温度42℃水浴中热击2分钟；

2.3.5.10 加入890μl LB液体培养基，混匀，37℃振荡培养1小时，使细胞恢复正常生长状态；得到大肠杆菌DH10B菌液；

2.3.5.11 分别取大肠杆菌DH10B菌液100μl涂布于含卡那霉素50mg/L的LB培养基平板，温度37℃、培养16～19小时，观察转化结果；

2.3.5.12 平板上长出的菌落即为转化子，提取转化子中的测序重组质粒pET-C，用限制性内切酶XhoⅠ、NdeⅠ酶切测序重组质粒pET-C，条件同上述2.3.3 酶切大肠杆菌质粒pET-28a(+)步骤，电泳图谱显示分别为1kb和5.3kb的条带，证明测序重组质粒pET-C构建正确；

2.4 测定测序重组质粒pET-C中mpd基因核苷酸序列，获得测序重组质粒pET-C中mpd基因核苷酸序列如下：

ATGCCCCTGAAGAACCGCTTGCTGGCCCGCCTGTCCTGTGTTGCGGCCGTGGTGGCCGCCACGGCCGCCGTTGCACCGTTGACGCTGGTGTCCACCGCCCACGCCGCCGCACCGCAGGTGCGCACCTCGGCCCCCGGCTACTACCGGATGCTGCTGGGCGACTTCGAAATCACCGCGCTGTCGGACGGCACGGTGGCGCTGCCGGTCGACAAGCGGCTGAACCAGCCGGCCCCGAAGACGCAGAGCGCGCTGGCCAAGTCCTTCCAGAAAGCGCCGCTCGAAACCTCGGTCACCGGTTACCTCGTCAACACCGGCTCCAAGCTGGTGCTGGTGGACACCGGCGCGGCCGGCCTGTTCGGCCCCACCCTGGGCCGGCTGGCGGCCAACCTCAAGGCCGCAGGCTATCAGCCCGAGCAGGTCGACGAGATCTACATCACCCACATGCACCCCGACCACGTGGGCGGCTTGATGGTGGGTGAGCAACTGGCGTTCCCGAACGCGGTGGTGCGTGCGGACCAGAAAGAAGCCGATTTCTGGCTCAGCCAGACCAACCTCGACAAGGCCCCGGACGACGAGAGCAAAGGCTTCTTCAAAGGCGCCATGGCCTCGCTGAACCCCTATGTGAAGGCCGGCAAGTTCAAGCCTTTCTCGGGGAACACCGACCTGGTGCCCGGCATCAAAGCGCTGGCCAGCCACGGCCACACCCCGGGCCACACCACCTACGTGGTCGAAAGCCAGGGGCAAAAGCTCGCCCTGCTCGGCGACCTGATACTCGTCGCCGCGGTGCAGTTCGACGACCCCAGCGTCACGACCCAGCTCGACAGCGACAGCAAGTCCGTCGCGGTGGAGCGCAAGAAGGCCTTCGCGGATGCCGCCAAGGGCGGCTACCTGATCGCGGCGTCCCACCTGTCGTTCCCCGGCATCGGCCACATCCGCGCCGAAGGCAAGGGCTACCGTTTCGTGCCGGTGAACTACTCGGTCGTCAACCCCAAGTGA

2.5 构建表达重组质粒pDA71-C 

2.5.1 用PCR扩增的方法从测序重组质粒pET-C中克隆mpd基因，扩增测序重组质粒pET-C上mpd基因的PCR扩增引物如下：

正向：5’- CG TCTAGAATGCCCCTGAAGAACCGCT-3’

反向：5’- CGGGTACCTCACTTGGGGTTGACGACC-3’

PCR反应参数：

预变性        94℃         5分钟，

变性          94℃         1分钟，

复性          56℃         1分钟，

延伸          72℃         1分钟， 

循环          30个，

终止延伸       72℃        10分钟，

得到测序重组质粒pET-C的PCR产物；

2.5.2 构建表达重组质粒pDA71-C

2.5.2.1 回收测序重组质粒pET-C的PCR产物

用1%琼脂糖电泳检测扩增的测序重组质粒pET-C的PCR产物，回收1kb的测序重组质粒pET-C的PCR产物片段；

2.5.2.2 酶切测序重组质粒pET-C的PCR产物

用两种限制性内切酶KpnⅠ、XbaⅠ分别酶切所述的测序重组质粒pET-C的PCR产物片段，酶切条件如下：

测序重组质粒pET-C的PCR产物片段          5μL

10倍的酶切缓冲液（10×L Buffer）            2μL

限制性内切酶KpnI                           0.5μL

无菌水补至20μL

37℃水浴4小时，加入1/10体积的10倍上样缓冲液，1%琼脂糖凝胶电泳，回收1kb的测序重组质粒pET-C的PCR产物的第一次酶切产物；

第二次酶切条件如下：

回收的1kb测序重组质粒pET-C的PCR产物的第一次酶切产物  10uL

10倍的酶切缓冲液（M Buffer）                              2μL

限制性内切酶XbaⅠ                                        0.5μL

无菌水补至20μL

37℃水浴4小时，加入1/10体积的10倍的上样缓冲液（10× Loading Buffer），

1%琼脂糖凝胶电泳，回收1kb的测序重组质粒pET-C的PCR产物的第二次酶切产物；

2.5.2.3 酶切质粒pDA71（美国标准菌种典藏中心American Type Culture Collection，缩写ATCC，检索号77474）

用两种酶KpnⅠ、XbaⅠ分别酶切质粒pDA71，酶切条件如下：

质粒pDA71                                5μL

10倍的酶切缓冲液（10×L buffer ）          2μL

限制性内切酶KpnI                          0.5μL

无菌水补至20μL

37℃水浴4小时，加入1/10体积的10倍的上样缓冲液（10× Loading Buffer），

1%琼脂糖凝胶电泳，回收质粒pDA71的第一次酶切产物；

第二次酶切条件如下：

回收的质粒pDA71的一次酶切产物           10μL

10倍的酶切缓冲液（10×M buffer）           2μL

限制性内切酶XbaⅠ                         0.5μL

无菌水补至20μL

37℃水浴4小时，加入1/10体积的10倍的上样缓冲液（10× Loading Buffer），

1％琼脂糖凝胶电泳，回收质粒pDA71的第二次酶切产物；

2.5.2.4 连接

用连接试剂盒将所述质粒pDA71的第二次酶切产物和测序重组质粒pET-C的PCR产物的第二次酶切产物连接，构建表达重组质粒pDA71-C；连接条件如下：

质粒pDA71的第二次酶切产物                        4uL

测序重组质粒pET-C的PCR产物的第二次酶切产物      4uL

10倍连接缓冲液（10×Ligase Buffer）                1uL

T4 DNA 连接酶（Ligase）                            1uL，

16℃水浴12－16小时，即得表达重组质粒pDA71-C连接产物，表达重组质粒pDA71-C连接产物中含有降解农药毒死蜱的mpd基因；

2.5.2.5 用表达重组质粒pDA71-C连接产物转化大肠杆菌DH10B感受态细胞

大肠杆菌DH10B感受态细胞的制备方法如上述2.3.5.1～2.3.5.6步骤；

用表达重组质粒pDA71-C连接产物转化大肠杆菌DH10B感受态细胞，将10μl表达重组质粒pDA71-C连接产物加入到100μl大肠杆菌DH10B感受态细胞中；操作方法如上述第2.3.5.8～2.3.5.12步骤，但在第2.3.5.11步骤中需用氨苄青霉素50mg/L取代卡那霉素，获得带有表达重组质粒pDA71-C的转化子；

采用公知的方法从带有表达重组质粒pDA71-C的转化子中提取表达重组质粒pDA71-C，具体提取方法如下：

将一环表达重组质粒pDA71-C的转化子接种到3mL含有氨苄青霉素（50mg/L）的LB液体培养基，37℃振荡培养过夜；取1.5mL菌液加入离心管中，4℃下10000r/min离心1min；弃上清，将管倒置吸水纸上，使液体流尽；

加入150μl用冰预冷的溶液Ⅰ（50mmol/L葡萄糖，25mmol/L三羟甲基氨基甲烷（Tris·Cl）pH 8.0，10 mM/L乙二胺四乙酸（EDTA），pH 8.0），剧烈振荡，重新悬浮菌体沉淀，室温放置3~5min；加入200μl新配制的溶液Ⅱ（0.2mol/L氯化钠（NaOH），1%十二烷基硫酸钠（SDS）），温和混匀，切勿剧烈振荡，室温5min；加入450μl预冷的溶液Ⅲ（乙酸钾溶液，pH 4.8），反复颠倒数次，温和混匀，室温5~10min；12000r/min离心5min；

将上清液转入干净的1.5mL 离心管中，加入1.5倍体积预冷无水乙醇，冰上放置10分钟，然后12000r/min离心10min；彻底弃去上清液，沿壁加入1mlL 70%乙醇漂洗沉淀，颠倒数次，立即去上清，自然干燥；将沉淀物溶于30μl TE缓冲液（10mM/L 三羟甲基氨基甲烷（Tris·Cl），1mM/L乙二胺四乙酸（EDTA），pH 8.0，含20μg/mL的核酸酶RNaseA））中，37℃保温30min后即为表达重组质粒pDA71-C；

采用与上述第2.5.2.3节中XbaⅠ酶切、KpnⅠ酶切同样的条件酶切表达重组质粒pDA71-C，1％琼脂糖电泳显示两个条带，大小分别为1kb和6.2kb，分别为微嗜酸寡养单胞菌G1菌株的mpd基因和微嗜酸寡养单胞菌G1菌株的pDA71质粒载体，证明表达重组质粒pDA71-C构建正确；

2.5.2.6 玫瑰红红球菌R-D3（Rhodococcus rhodochrous R-D3）的转化 

2.5.2.6.1 玫瑰红红球菌R-D3菌株电转化感受态细胞的制备

2.5.2.6.1.1 按1%的接种量将玫瑰红红球菌R-D3菌株接种到100mL 的LB培养基中，温度30℃，培养18-24小时，得到玫瑰红红球菌R-D3菌株的扩大培养物，简称R-D3菌株的扩大培养物；

2.5.2.6.1.2 取10mL R-D3菌株的扩大培养物，4000转/分钟离心10分钟，弃去上清液，收集细胞，用4℃的无菌水洗涤1次，再用4℃10%甘油洗涤2次；

2.5.2.6.1.3 离心2次后，弃去上清液，用1mL浓度10%的甘油重悬，得到玫瑰红红球菌R-D3菌株感受态细胞；

2.5.2.6.2 用表达重组质粒pDA71-C电转化玫瑰红红球菌R-D3菌株感受态细胞，步骤如下：

2.5.2.6.2.1 取1μL表达重组质粒pDA71-C与80μL的玫瑰红红球菌R-D3菌株感受态细胞混合，移入电击杯中，冰浴10分钟；将电击杯置于电击槽中电击，电击参数：电击杯0.2cm，电压2.0kV，电击时间3.5ms；

2.5.2.6.2.2 电击完毕，立即向杯中加入420μL的LB培养液，温度30℃、振荡培养3小时，即为电击转化产物；

2.5.2.6.2.3 将电击转化产物涂布含50μg/mL氨苄青霉素和200mg/L农药毒死蜱乳油制剂的牛肉膏蛋白胨平板，30℃培养5天；

2.5.2.6.3 玫瑰红红球菌R-D3中mpd基因表达的检测

平板上出现菌落，有的菌落周围出现透明的水解圈，有的菌落周围没有透明的水解圈；有透明水解圈者，是由于这些菌落中的细胞的mpd基因表达，降解农药毒死蜱，因而形成透明的水解圈；证明微嗜酸寡养单胞菌G1菌株的mpd基因在这些菌落的细胞中表达，降解农药毒死蜱，出现水解圈；这些菌落即为表达mpd基因的玫瑰红红球菌R-D3（Rhodococcus rhodochrous R-D3），基因核苷酸序列如下：

ATGCCCCTGAAGAACCGCTTGCTGGCCCGCCTGTCCTGTGTTGCGGCCGTGGTGGCCGCCACGGCCGCCGTTGCACCGTTGACGCTGGTGTCCACCGCCCACGCCGCCGCACCGCAGGTGCGCACCTCGGCCCCCGGCTACTACCGGATGCTGCTGGGCGACTTCGAAATCACCGCGCTGTCGGACGGCACGGTGGCGCTGCCGGTCGACAAGCGGCTGAACCAGCCGGCCCCGAAGACGCAGAGCGCGCTGGCCAAGTCCTTCCAGAAAGCGCCGCTCGAAACCTCGGTCACCGGTTACCTCGTCAACACCGGCTCCAAGCTGGTGCTGGTGGACACCGGCGCGGCCGGCCTGTTCGGCCCCACCCTGGGCCGGCTGGCGGCCAACCTCAAGGCCGCAGGCTATCAGCCCGAGCAGGTCGACGAGATCTACATCACCCACATGCACCCCGACCACGTGGGCGGCTTGATGGTGGGTGAGCAACTGGCGTTCCCGAACGCGGTGGTGCGTGCGGACCAGAAAGAAGCCGATTTCTGGCTCAGCCAGACCAACCTCGACAAGGCCCCGGACGACGAGAGCAAAGGCTTCTTCAAAGGCGCCATGGCCTCGCTGAACCCCTATGTGAAGGCCGGCAAGTTCAAGCCTTTCTCGGGGAACACCGACCTGGTGCCCGGCATCAAAGCGCTGGCCAGCCACGGCCACACCCCGGGCCACACCACCTACGTGGTCGAAAGCCAGGGGCAAAAGCTCGCCCTGCTCGGCGACCTGATACTCGTCGCCGCGGTGCAGTTCGACGACCCCAGCGTCACGACCCAGCTCGACAGCGACAGCAAGTCCGTCGCGGTGGAGCGCAAGAAGGCCTTCGCGGATGCCGCCAAGGGCGGCTACCTGATCGCGGCGTCCCACCTGTCGTTCCCCGGCATCGGCCACATCCGCGCCGAAGGCAAGGGCTACCGTTTCGTGCCGGTGAACTACTCGGTCGTCAACCCCAAGTGA。