[发明专利]表达mpd基因的玫瑰红红球菌及其构建方法

说明书

技术领域

本发明属于环境生物工程和基因工程，具体涉及采用分子生物学技术克隆农药毒死蜱的降解酶基因，构建基因工程菌株，快速降解污染环境的毒死蜱。

背景技术

我国是一个农业大国，农药的生产量和使用量均呈逐年递加之势。农药在农业生产上的大量应用，对于防治农作物病虫害方面起到了极其重要的作用，为粮食丰收提供了可靠的保证。但是长期大量地使用农药使得环境中的农药污染日益严重，危及人们身体健康、食品安全及其他环境问题。有机磷类农药得到长期、广泛、大量的应用，其中毒死蜱是世界上使用量最大的农药之一。在我国，毒死蜱是甲胺磷和甲基对硫磷等高毒农药的新型高效、低毒替代品种，生产量和使用量很大。虽然毒死蜱是低毒的农药，但是使用量之大、使用范围之广，已对我国大部分地区的土壤、水体造成了严重的污染。存储在土壤、水体中的毒死蜱不仅对动植物、微生物等生命体产生毒害作用，而且，毒死蜱还直接和间接地影响了人类的健康，所以，需要研发高效清除毒死蜱等有机磷残留污染的生态修复技术，为农业安全生产和环境安全提供技术支持和参考。

已经报道采用降解毒死蜱的酶来清除环境中的毒死蜱残留，但这种技术的效率不高，只能进行小规模试用。采用基因工程技术构建高效降解菌株，将会提高降解效率，为污染环境的生物修复提供可实用的材料。

本发明的菌种已按专利法实施细则第二十五条第三款的规定在国家知识产权局专利局指定的保藏单位——中国典型培养物保藏中心保藏，地址：中国 武汉 武汉大学；玫瑰红红球菌R-D3（Rhodococcus rhodochrous R-D3）菌株的保藏日期：2010年9月15日，保藏号：CCTCC M 2010232，并附具存活性报告书；微嗜酸寡养单胞菌 G1（Stenotrophomonas acidaminiphila G1）菌株的保藏日期：2010年9月15日，保藏号：CCTCC M 2010231，并附具存活性报告书。

发明内容

为了解决农药污染的生物修复问题，本发明提供一种生物材料及构建方法，即用于降解毒死蜱的一种表达mpd基因的玫瑰红红球菌及其构建方法。

表达mpd基因的玫瑰红红球菌R-D3（Rhodococcus rhodochrous R-D3），其基因核苷酸序列如下：

ATGCCCCTGAAGAACCGCTTGCTGGCCCGCCTGTCCTGTGTTGCGGCCGTGGTGGCCGCCACGGCCGCCGTTGCACCGTTGACGCTGGTGTCCACCGCCCACGCCGCCGCACCGCAGGTGCGCACCTCGGCCCCCGGCTACTACCGGATGCTGCTGGGCGACTTCGAAATCACCGCGCTGTCGGACGGCACGGTGGCGC T GCCGGTCGACAAGCGGCTGAACCAGCCGGCCCCGAAGACGCAGAGCGCGCTGGCCAAGTCCTTCCAGAAAGCGCCGCTCGAAACCTCGGTCACCGGTT AC CTCGTCAACACCGGCTCCAAGCTGGTGCTGGTGGACACCGGCGCGGCCGGCCTGTTCGGCCCCACCCTGGGCCGGCTGGCGGCCAACCTCAAGGCCG

表达mpd基因的玫瑰红红球菌R-D3（Rhodococcus rhodochrous R-D3）的构建方法包括以下操作步骤：

2.1 提取微嗜酸寡养单胞菌G1（Stenotrophomonas acidaminiphila G1）菌株的基因组DNA；

2.2 以所述基因组DNA为模板PCR扩增微嗜酸寡养单胞菌G1（Stenotrophomonas acidaminiphila G1）菌株的mpd基因，扩增引物序列如下：

正向：5’-GAATTCATATGCCCCTGAAGAAC-3’

反向：5’-GAATTCTCGAGCTTGGGTTGACGACCG-3’

PCR扩增反应参数：

预变性        94℃         5分钟，

变性          94℃         1分钟，

复性          58℃         1分钟，

延伸          72℃         1分钟，

循环          30个，

终止延伸       72℃        10分钟，