[发明专利]一种高效复制的人乙型肝炎病毒重组载体及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程、基因治疗和生物医药领域，具体涉及一种高效复制的重组人乙型肝炎病毒载体及其以及靶向肝脏或肝细胞特异性的导入外源基因的应用。

背景技术

肝脏疾病如慢性病毒性肝炎、肝硬化、肝癌、代谢障碍引起的肝病、药物及其它原因引起的中毒性肝病、自身免疫性肝病等是临床常见病，对机体健康危害极大，其中许多疾病尚没有很有效的治疗手段，迫切需要新型治疗方法或药物，而肝脏或肝细胞特异的基因治疗方法具有潜在的药物开发价值。

基因治疗最关键的同时也是最困难的问题在于如何将外源基因特异并高效地导入特定组织器官内的特定类型的靶细胞，并使其在靶细胞内持续性地表达。对肝脏的基因导入尤为困难，由于肝内kupffer（枯否氏）细胞的吞噬作用，用脂质体方法很难有效地将外源基因导入肝实质细胞；而使用现有的重组病毒载体如腺病毒载体、慢病毒载体等将外源基因导入到肝实质细胞的效果也不理想，原因至少可部分归结于这些病毒的感染并不是肝特异性的。

相对现有的重组病毒载体，人乙型肝炎病毒（HBV）（以下简称乙肝病毒）只感染人肝细胞，因此，是否能够利用乙肝病毒的这一特点将其开发为肝脏基因治疗的重组病毒载体一直受到关注。

乙肝病毒具有部分环状双链的DNA基因组，长度约为3.2kb，含有四个基本阅读框架，它们分别是C基因，编码核心蛋白（核心抗原）和分泌的e蛋白（e抗原）；S基因，编码大、中和小表面蛋白（表面抗原）,大蛋白和中蛋白相比小蛋白，在氨基端分别多preS（由preS1+preS2组成）和preS2；P基因，编码聚合酶；X基因，编码X蛋白。

乙肝病毒的感染始于病毒附着在肝细胞上，通过未知的机制，病毒外膜与细胞膜发生融合，病毒核衣壳被释放到细胞质中并解聚，病毒基因组转移到细胞核内，在细胞修复酶的作用下形成闭合环状DNA（cccDNA）。随后，病毒以cccDNA为模板转录产生四种mRNA，分别是3.5kb pgRNA、2.4kb mRNA、2.1kb mRNA和0.8kb mRNA。2.4kb和2.1kb的mRNA指导表面蛋白的翻译，0.8kb mRNA指导X蛋白的翻译，而3.5kb pgRNA除了指导核心蛋白和聚合酶的翻译外，还作为病毒的前基因组RNA被新产生的核心蛋白和聚合酶包裹形成新的核衣壳。在核衣壳中，病毒聚合酶以pgRNA为模板通过反转录合成新的DNA基因组。最终，完成DNA复制的核衣壳被表面蛋白包裹，形成成熟的病毒粒子，分泌出细胞，开始新的感染周期。

乙肝病毒的聚合酶在病毒DNA的复制中占有核心地位。不同基因型的乙肝病毒的聚合酶大小稍有差异。聚合酶可分为四个结构域，分别为末端蛋白（TP）、间隔区（Spacer或SP）、反转录酶（RT）和核酸酶H（RNaseH）。TP、RT和RNaseH活性在乙肝病毒DNA的复制中都不可缺少，而SP的功能不是很清楚，可能主要起连接TP和RT的作用。

乙肝病毒的嗜肝性主要体现在感染细胞和病毒基因转录调控两个层面上。首先，乙肝病毒选择性地感染人肝细胞；其次，乙肝病毒基因的转录受到病毒携带的四个启动子和两个增强子的调控，许多肝细胞特异或富集的转录调控因子参与调节这些元件的活性〔Seeger C and Mason W, 2000. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 64:51-68〕。

乙肝病毒的嗜肝性使其在理论上有可能成为肝脏基因治疗的理想病毒载体。但是，由于乙肝病毒的基因组很小，仅为3.2kb，病毒基因之间及基因与调控区之间相互重叠，病毒核衣壳的容量又极为有限（实验证明基因组DNA若大于3.5kb就无法检测到病毒的复制），因此，对乙肝病毒基因组进行人工改造使其能够容纳一定长度的外源基因，且不影响病毒的高效复制就显得非常困难，国际上的一些尝试都未能获得成功（Chaisomchit S, Tyrrell D, Chang L, 1997. Gene Therapy. 4:1330-1340）。

发明内容

本发明的目的是提供一种在肝脏细胞中特异表达外源基因的载体。

本发明的另一个目的是提供上述载体在基因治疗中的应用。