[发明专利]草鱼呼肠孤病毒快速检测试纸及其制备、使用方法

说明书

技术领域

本发明涉及养殖病害病原检测技术的改进，具体讲是一种草鱼呼肠孤病毒(Grass carp reovirus，GCRV)快速检测试纸及其制备、使用方法，属于免疫学和病毒学交叉技术领域。

背景技术

草鱼呼肠孤病毒病是草鱼养殖中危害严重的疾病之一，导致很高的草鱼死亡率，可达70-80％的死亡率，给草鱼养殖业造成了巨大的损失。该病毒引起的疾病又称为草鱼出血病，其出血症状常与细菌引起的出血很难鉴别，又鉴于草鱼出血病尚无有效的治疗方法，因而简便、快速的检测方法尤显重要，以期达到早发现、早预防的目的。快速准确的病毒分离检测技术已成为学者研究的焦点之一。

目前，病毒性草鱼出血病的诊断主要是依靠实验室内对草鱼呼肠孤病毒检测来确诊，现实验室检测方法有：葡萄球菌A蛋白协同凝集试验(杨广智1991)；酶联免疫吸附检测法(江育林1993)；荧光抗体技术检测法(江育林1993)；斑点免疫印迹检测法(邵健忠1996)；免疫吸附电镜观察法(袁爱华1990)；逆转录聚合酶链式反应法(王铁辉1997)等。这些方法，操作程式较为复杂，需要一定的实验室仪器设备，且耗时较长，整个过程需要几个乃至十几个小时，达不到快速检测的目的。逆转录聚合酶链式反应法灵敏度高，可用于无症状病鱼的检测，但其高灵敏度易导致假阳性结果；酶联免疫吸附检测法及斑点免疫印迹检测法，是目前常用的检测方法，但被检组织的内源酶可以对其检测结果产生干扰，导致假阳性的出现。因此一种适用于水产养殖病害病原的快速、准确、简便、快速、无假阳性的检测方法的研制势在必行，以期达到早发现、早预防的目的。

发明内容

本发明针对草鱼呼肠孤病毒病严重危害草鱼养殖业的现状，针对水生生物生理特点，设计发明提供一种能够达到快速、简便、准确检测目的的草鱼呼肠孤病毒快速检测试纸及其制备、使用方法。

本发明的技术方案实现如下

草鱼呼肠孤病毒快速检测试纸，其包括：保藏号为：CCTCC-C201103杂交瘤细胞所分泌的抗草鱼呼肠孤病毒、胶体金标记的单克隆抗体C(简称：金标单抗C)；保藏号为：CCTCC-C201104杂交瘤细胞所分泌的抗草鱼呼肠孤病毒的单克隆抗体D(简称：单抗D)和羊抗小鼠IgG；适当尺寸的不干胶载体板；其特殊之处在于在该载体板的中间部设有由粘贴包被有单抗D(又称：检测线)和羊抗小鼠IgG(又称：质控线)的硝酸纤维膜制成的检测层；与该层相延续的两端设置吸水纸分别构成加样端吸水层和手持端吸水层；在检测层的检测线的远端与加样端吸水层交界处，设有载有金标单抗C的玻璃纤维膜，该膜一端部分设置在加样端吸水层之下，其另一端部分设置在检测层之上。

所述的金标单抗C制备：

是以公知的胶体金的制备工艺制备胶体金溶液，胶体金的颗粒大小为10-20nm，将单克隆抗体C加入到上述的胶体金溶液中，慢搅混匀，加入牛血清白蛋白，离心后的沉淀用含有1-10％牛血清白蛋白和0.3-3％吐温-20的磷酸盐缓冲液悬起，加入叠氮钠，制成金标单抗C。

所述的载有金标单抗C的玻璃纤维膜的制备：

将金标单抗C液体，按每平方厘米700-1000μl喷在玻璃纤维膜上，冷冻干燥，4℃保存备用。

草鱼呼肠孤病毒快速检测试纸的使用方法：将该试纸的加样端吸水层插入或在其上滴加被检测样品，5-10分钟内在位于检测层上的检测线和质控线处显示红色，即双红线，表示草鱼呼肠

所述的检测样品制备的过程是：取被检草鱼肾脏加入至离心管中，按质量/体积1∶(5-10)(g/ml)加入0.01mol/L pH为6-8的磷酸盐缓冲液，用捣碎棒将草鱼肾脏捣碎，使病毒释放于该离心管液体中，即制成检测样品。

本发明草鱼呼肠孤病毒快速检测试纸的检测原理：