[发明专利]一种PheRS酶活测定体系以及PheRS抑制剂的筛选方法

权利要求书

1.一种PheRS酶活测定体系，其特征在于，含有如下浓度的反应物：

反应物                终浓度

Hepes                 90～110mM

MgCl₂                 9～11mM

Phe                   2.3～2.7mM

tRNA                  50μg/100μl

ATP                   1.8～2.2mM

PEP                   0.9～1.1mM

NADH                  1.3～1.7mM

PheRS                 3.5～4.5μg/100μl

肌激酶                1.6～2.0U/100μl

丙酮酸激酶            1.6～2.0U/100μl

乳酸脱氢酶            1.6～2.0U/100μl。

2.根据权利要求1所述的体系，其特征在于，含有如下浓度的反应物：

反应物                终浓度

Hepes                 100mM

MgCl₂                 10mM

Phe                   2.5mM

tRNA                  50μg/100μl

ATP                   2.0mM

PEP                   1.0mM

NADH                  1.5mM

PheRS                 4μg/100μl

肌激酶                1.8U/100μl

丙酮酸激酶            1.8U/100μl

乳酸脱氢酶            1.8U/100μl。

3.一种筛选结核分枝杆菌PheRS抑制剂的方法，包括如下步骤：

1)配制权利要求1或2所述的体系；

2)设置如下各反应组：

i)样品实验组：向步骤1)配制好的反应体系中加入化合物的样品溶液或者菌株发酵液的样品溶液；

ii)阳性实验组：配制不含PheRS的步骤1)所述的反应体系；

iii)阴性对照组：向步骤1)所述反应体系中加入等量的i)中溶解化合物样品所用的溶剂DMSO或者等量的用于菌株发酵的发酵培养基；

3)将步骤2)各反应组分别混合均匀，置于酶标仪内反应，测定各反应组OD₃₄₀吸光值变化量，计算反应抑制率，对反应具有抑制作用的即为阳性样品。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，当步骤2)i)中的样品为化合物时，加入溶剂制成样品溶液，向反应体系中加入该样品溶液，使样品的终浓度为18-22μM，作为样品反应组。

5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，当步骤2)i)中的样品为菌株发酵液时，取发酵液挥干后加入溶剂制成样品溶液，加入到反应体系中，作为样品反应组。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述菌株发酵液的生产方式为：从斜面上挑取0.5cm²菌株培养物种入盛有50ml发酵培养基的瓶中，28℃、190转/分旋转摇床培养4天。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述发酵培养基组成为：葡萄糖5g；麦芽膏10g；棉子饼粉10g；淀粉20g；酵母膏5g；K₂HPO₄ 0.5g；(NH4)₂SO₄ 5g；CaCO₃ 3g；NaCl 1g加水至终体积1L，调pH至7.2。