[发明专利]一种PheRS酶活测定体系以及PheRS抑制剂的筛选方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物医药领域，具体涉及一种结核分枝杆菌PheRS酶活测定体系以及PheRS抑制剂的筛选方法。

背景技术

近年来，曾经被有效控制的结核病大有卷土重来之势，已成为与艾滋病、疟疾并称的传染病三大杀手。结核病死灰复燃的原因中很重要的一个方面就是多重耐药菌的增加。因此，寻找新的有效的抗结核药物已成为我国乃至世界结核病防治重要任务。目前世界各国的新药筛选部门都普遍采用靶向筛选来筛选新药：即从病原微生物生长繁殖所必需的某一组分或是从其耐药机理入手，将其作为候选新药的作用靶位，设计特定的筛选模型，并利用模型有针对性地从微生物代谢产物或化合物库中进行筛选，以期得到对有效的新型抗细菌药物。

在蛋白质的生物合成过程中，氨酰-tRNA合成酶起了至关重要的作用，它催化氨基酸与相应的tRNA合成氨酰-tRNA，是遗传信息通过蛋白质形式得以表达所必需的一个组分，是各类生物体生存所必不可少的一类酶。对于病原菌而言，一旦它的某种氨酰-tRNA合成酶受到抑制失去功能，就会导致其蛋白质的生物合成中断以及许多重要的生理过程受影响，病原菌的生长繁殖也就随之终止。因此，氨酰-tRNA合成酶适于作为新型抗菌药物的作用靶点。由此可见，目前迫切需要一种特异性强的筛选方法，建立崭新、低毒、高效的筛选模型。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明提供一种优化的PheRS酶活测 定体系。

本发明的PheRS酶活测定体系以ddH₂O为溶剂，含有如下浓度的反应物：

反应物                终浓度

Hepes                 90～110mM

MgCl₂                 9～11mM

Phe                   2.3～2.7mM

tRNA                  50μg/100μl

ATP                   1.8～2.2mM

PEP                   0.9～1.1mM

NADH                  1.3～1.7mM

PheRS                 3.5～4.5μg/100μl

肌激酶                1.6～2.0U/100μl

丙酮酸激酶            1.6～2.0U/100μl

乳酸脱氢酶            1.6～2.0U/100μl。

优选地，本发明的PheRS酶活测定体系含有如下浓度的反应物：

反应物                终浓度

Hepes                 100mM

MgCl₂                 10mM

Phe                   2.5mM

tRNA                  50μg/100μl

ATP                   2.0mM

PEP                   1.0mM

NADH                  1.5mM

PheRS                 4μg/100μl

肌激酶                1.8U/100μl

丙酮酸激酶            1.8U/100μl

乳酸脱氢酶            1.8U/100μl。

本发明的另一个目的是提供筛选结核分枝杆菌PheRS抑制剂的方法，该方法包括如下步骤：

1)配制上述PheRS酶活测定体系，作为反应体系：

2)设置如下各反应组：

i)样品实验组：向步骤1)配制好的反应体系中加入化合物的样品溶液或者菌株发酵液的样品溶液；

ii)阳性对照组：配制不含PheRS的步骤1)所述的反应体系；

iii)阴性对照组：向步骤1)所述反应体系中加入等量的i)中溶解化合物样品所用的溶剂DMSO或者等量的用于菌株发酵的发酵培养基；

3)将步骤2)各反应组分别混合均匀，置于酶标仪内反应，测定各反应组OD₃₄₀吸光值变化量，计算反应抑制率，对反应具有抑制作用的即为阳性样品。