[发明专利]一种预测干扰素治疗慢性乙型肝炎疗效的血浆miRNA谱及检测试剂盒

说明书

技术领域

　　本发明涉及分子生物学和医学领域。更具体地，涉及血浆miRNA表达水平预测干扰素治疗慢性乙肝疗效。本发明还涉及检测miRNA水平的方法和试剂盒。

背景技术

乙型肝炎病毒（HBV）感染能引起慢性肝脏疾病并显著增加罹患肝细胞癌的风险。虽然已广泛使用乙肝表面抗原重组抗原疫苗预防感染，HBV感染仍然是世界各国的重要健康问题。干扰素α与核苷类似物，如拉米夫定、阿德福韦、恩替卡维、替比夫定等是HBV感染的主要治疗药物。干扰素治疗通常只能在有限的病人中获得完全应答，中止治疗后容易复发。近年来应用聚乙二醇化干扰素(又称长效干扰素，主要有PEG-IFNα2a, PEG-IFNα2b两种)显著提高了e抗原血清转换(PEG-IFNα2a 32% ， PEG-IFNα2b 36%) 和一小部分病人表面抗原血清转换(2.9%， PEG-IFNα2a)。然而，长效干扰素容易引发如流感样症状、抑郁、性格改变等副作用。核苷类似物，如拉米夫定、阿德福韦、恩替卡维、替比夫定等，是乙肝逆转录聚合酶的有效抑制剂，能阻断病毒基因组复制。但是，这类药物治疗不能获得较高的血清转换率，且有很大一部分病人在停止用药后复发。另外，长期使用容易引起耐药突变的形成。

尽管近些年在慢性乙肝的治疗手段、病毒血清转换率和病毒学应答方面都有了显著提高， 慢性乙肝的治疗效果仍不够理想。特别是长效干扰素对于发展中国家的低收入家庭非常昂贵。因此，目前急需能够在治疗前预测干扰素治疗效果的方法，从而为个人化治疗提供解决方案。

目前已知的与治疗预后相关的因素有： 1. 治疗前ALT水平， 2. 治疗前HBV DNA, 3. 性别， 4. 肝脏组织学状态， 5. 治疗过程中HBsAg低度变化动态。 然而，目前的指标的预测能力有限，急需一种能在血液中中检测的，有较高预测准确度的分子标记。

发明内容

本发明要解决的技术问题是确定一种能在血液中中检测的，有较高预测准确度的分子标记。

近年来的研究显示小非编码RNA（约22和核苷酸），又称小RNA（microRNA,miRNA）。小RNA存在于各类组织中，能通过与靶mRNA3’未翻译末端核苷酸配对促进其降解或抑制翻译。miRNA是由长前体RNA进行转录产生，并被Drosha（一种核酸酶）预处理后通过exportin-5介导的出核过程转运到细胞浆。miRNA进一步被DICER酶剪切，最后形成17-24个核苷酸的成熟miRNA，并与RISC复合体结合，执行基因沉默功能。小RNA是一类在血浆中存在的短核苷酸，已有报道证明可以作为肝脏损伤和妊娠的非常敏感的分子标记。

本发明经过大量研究，确定了一种预测干扰素治疗慢性乙型肝炎疗效的血浆miRNA谱，该miRNA谱包括SEQ ID NO 1-11中一个或多个miRNA。

并且，根据该miRNA谱提供了一种预测干扰素治疗慢性乙型肝炎疗效的试剂盒，该试剂盒含有针对SEQ ID NO 1-11中一个或多个miRNA特异性探针核苷酸。

同时，提供了一种预测干扰素治疗慢性乙型肝炎疗效的芯片，该芯片含有针对SEQ ID NO 1-11中一个或多个miRNA特异性探针核苷酸。

本发明还提供了一种预测干扰素治疗慢性乙型肝炎疗效的方法，即检测SEQ ID NO 1-11中一个或多个miRNA在使用干扰素前血浆、血清样品中表达水平，对样品中表达水平与标准水平差异利用统计方法分析预测干扰素疗效。

所述miRNA中至少一种的表达水平高于或者低于已知的标准水平。

具体的，该方法包括步骤：（1） 血浆、血清样本小RNA的抽提， （2）   核酸样本与具有如SEQ ID No.1-11中一个或多个miRNA特异性探针的芯片进行杂交， （3） 对杂交信号与对照样本的杂交结果进行比较。

所述的统计方法是分析样品中表达水平与标准水平差异的显著性。

所述的统计方法包括： miRNA表达谱通过最大关联度最小冗余度分析对每个miRNA评分；利用近邻分类算法作为预测引擎进行类别判断；特征值递增分析法和留一法交叉验证优化入选miRNA的数量。

本发明中，乙肝病人治疗前部分miRNA的表达谱能够预测干扰素α治疗效果，并据此公开了相关miRNA的检测方法、预测模型建立的方法及检测试剂盒。