[发明专利]生产转基因山羊的piggyBac转座子载体构建方法及其应用

权利要求书

1.一种生产转基因山羊的piggyBac转座子载体的构建方法，其特征在于包括如下步骤：合成一段包含piggyBac转座子发生转座所必需的PB碱基序列然后将该序列克隆到pBluSKm载体中构建成pBluSKm-PB载体；再将瘤胃特异表达启动子PRD-SPRR II、经密码子偏好性优化的羊半胱氨酸合成基因cysE和cysM、Neomycin抗性基因和绿色荧光蛋白基因克隆到pBluSKm-PB载体中最终构建成pBluSKm-PB-PRD-cysEM-NEO-EGFP转座子载体，所述的PB碱基序列为：

CCCCCCGGTACCCCCTAGAAAGATAGTCTGCGTAAAATTGACGCATGCATTCT

TGAAATATTGCTCTCTCTTTCTAAATAGCGCGAATCCGTCGCTGTGCATTTAGG

ACATCTCAGTCGCCGCTTGGAGCTCCCGTGAGGCGTGCTTGTCAATGCGGTA

AGTGTCACTGATTTTGAACTATAACGACCGCGTGAGTCAAAATGACGCATGAT

TATCTTTTACGTGACTTTTAAGATTTAACTCATACGATAATTATATTGTTATTTCA

TGTTCTACTTACGTGATAACTTATTATATATATATTTTCTTGTTATAGATATCAGAT

CTCCCCCCCGCTAGCCCCCCCCGTCGACCCCCCCCATCGATCCCCCCCCCACG    

CGTTAAAAGTTTTGTTACTTTATAGAAGAAATTTTGAGTTTTTGTTTTTTTTTAA

TAAATAAATAAACATAAATAAATTGTTTGTTGAATTTATTATTAGTATGTAAGTG

TAAATATAATAAAACTTAATATCTATTCAAATTAATAAATAAACCTCGATATACA

GACCGATAAAACACATGCGTCAATTTTACGCATGATTATCTTTAACGTACGTCA

CAATATGATTATCTTTCTAGGGCCGCGGCCCCCCC。

2.根据权利要求1所述的构建载体的方法，其中在克隆PRD-SPRR II基因时所用到的引物序列为：

PRD-SPRR II-F  GGATCCTGATTTAAATTAACTTGG

PRD-SPRR II-R  GCTAGTATGGTGAGGCATCCTTCCTG。

3.根据权利要求1所述的构建载体的方法，其中克隆cysE和cysM基因包括以下步骤：在cysE和cysM序列之间加入核糖体结合位点IRES序列，在cysM序列末端添加BGH pola序列，然后在起始端和末尾段分别加上NheI和SalI酶切位点，所合成基因cysE-IRES-cysM和pBluSKm-PB-PRD质粒分别用NheI和SalI双酶切，酶切产物回收后用T4 DNA连接酶连接，构建成pBluSKm-PB-PRD-cysEM载体。

4.根据权利要求1-3任意一项所述的构建载体的方法，其中在克隆Neomycin抗性基因时所用到的引物序列为：

NEO-F  GTCGACCTGTGGAATGTGTGTCAG；

NEO-R  ATCGATCAGACATGATAAGATACATTG。

5.根据权利要求1-4任意一项所述的构建载体的方法，其在在克隆绿色荧光蛋白基因时所用到的引物序列为：

EGFP-F  ATCGATTAGTTATTAATAGTAATCAATTAC

EGFP-R  ACGCGTGCAGTGAAAAAAATGCTTTATT。

6.权利要求1-5任意一项所述构建方法所构建的载体。

7.根据权利要求6所述的载体，其特征在于所述载体的长度为12531bp。

8.权利要求6或7所述的载体的用途，其特征在于所述用途在细胞转染中的用途。

9.根据权利要求8所述的用途，其特征在于所述细胞为羊的细胞。

10.权利要求6或7所述的载体在提高山羊绒毛产量和/或质量中的用途。