[发明专利]生产转基因山羊的piggyBac转座子载体构建方法及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及基因载体，具体涉及转基因山羊的piggyBac转座子载体的构建方法及其应用。

背景技术

研究已证实半胱氨酸是绒毛生长的主要限制性氨基酸，体内缺乏将限制绒毛生长。而山羊直接饲喂半胱氨酸大部分被瘤胃微生物分解损失掉而不能参与到绒毛生成。为了解决该问题，半胱氨酸通常用皱胃灌注或血管注射等方式来提高绒毛生长(J.Anita.Sci.1992，70，3188-3193)，该方式虽然有一定效果，但费时费力，需要一定的经济投入，生产中也不便大面积推广。随着生物技术的发展，研究发现控制细菌生成半胱氨酸的基因cysE(丝氨酸乙酰转移酶基因)和cysM(O-乙酰丝氨酸氢硫基酶基因)转入到哺乳动物细胞中也能合成半胱氨酸(Proc.Nat lAcad.Sci.USA，1988，85，8047-8051)。基于该发现，澳大利亚绵羊育种学家(Bawden(Bawden，C.S.Expression of microbial cysteine biosynthesis genes in sheep by transgenesis[D].South Australia：University of Adelaide，Adelaide，1991)提出将细菌的半胱氨酸合成基因转入到绵羊体内指导瘤胃上皮合成半胱氨酸，最后通过瘤胃上皮细胞吸收以满足羊毛生长所需。1995年，Bawden等人用小鼠磷酸激酶启动子构建表达载体通过显微注射法生产了带有cysE和cysM基因的转基因羊，但cysE和cysM的表达产物在绵羊体内非常低。Bawden建议采用瘤胃特异启动子来提高绵羊体内半胱氨酸的表达量(Transgenic Research，1995，4，87-104)。

piggyBac转座子是一类来源于鳞翅目昆虫夜粉蛾的DNA转座子，在哺 乳动物细胞及小鼠中具有很高活性。2005年上海复旦大学丁昇等人在piggyBac转座子研究方面取得了重大突破，他们的研究结果表明piggyBac转座子可以在人和小鼠细胞中高效导入基因并稳定表达，并具有携带基因容量大，操作简便等优点(丁昇.piggyBac转座系统-哺乳动物遗传分析的新工具[D].上海：复旦大学，2007)，他们利用piggyBac转座子建立了高效小鼠基因插入突变及筛选技术，在不到一年内培育了数百个小鼠突变体。该研究证明利用piggyBac转座子在小鼠等哺乳动物中高效、大规模研究基因功能和转基因已成为可能。

目前，国际、国内还未见报道利用PiggyBac转座子构建载体进行山羊转基因的报道。

发明内容

本发明的目的在于，提供一种用于提高山羊产绒质量和/或数量piggyBac转座子载体构建方法。本发明的优点在于构建的新型piggyBac转座载体，可将半胱氨酸合成基因cysE和cysM基因在山羊瘤胃上皮表达，能应用于生产带cysE和cysM基因的转基因山羊，提高绒毛产量和质量。该表达载体同时具有一个EGFP报告基因和一个NEO抗性筛选基因，可便于核移植和细胞筛选。

为了实现上目的，本发明采取如下技术方案：

本发明一方面涉及一种生产转基因山羊的piggyBac转座子载体的构建方法，其特征在于包括如下步骤：合成一段包含piggyBac转座子发生转座所必需的PB碱基序列然后将该序列克隆到pBluSKm载体中构建成pBluSKm-PB载体；再将瘤胃特异表达启动子PRD-SPRR II、经密码子偏好性优化的半胱氨酸合成基因cysE和cysM、Neomycin抗性基因和绿色荧光蛋白基因克隆到pBluSKm-PB载体中最终构建成pBluSKm-PB-PRD-cysEM-NEO-EGFP转座子载体，所述的PB碱基序列为：

CCCCCCGGTACCCCCTAGAAAGATAGTCTGCGTAAAATTGACGCATGCATTCT

TGAAATATTGCTCTCTCTTTCTAAATAGCGCGAATCCGTCGCTGTGCATTTAGG

ACATCTCAGTCGCCGCTTGGAGCTCCCGTGAGGCGTGCTTGTCAATGCGGTA

AGTGTCACTGATTTTGAACTATAACGACCGCGTGAGTCAAAATGACGCATGAT

TATCTTTTACGTGACTTTTAAGATTTAACTCATACGATAATTATATTGTTATTTCA

TGTTCTACTTACGTGATAACTTATTATATATATATTTTCTTGTTATAGATATCAGAT