[发明专利]用于研究肝细胞癌上皮间质样变的动物模型的构建方法

说明书

技术领域

本发明涉及构建一种用于研究肝细胞肝癌上皮间质样变动态过程的动物模型，本发明也可成为针对肝癌细胞上皮间质样变过程的靶向抗肿瘤药物研发的理想验证平台。

背景技术

原发性肝癌是高度恶性的肿瘤之一，其死亡率位于我国恶性肿瘤的第二位。绝大多数肝癌病人死亡与肝癌复发、转移相关。研究表明肝癌复发、转移是多基因参与、多步骤完成复杂过程，包括肿瘤细胞粘附、迁移和肿瘤细胞对细胞外基质的降解等，目前，其发生的分子机制尚不完全清楚，进一步探索研究肝癌复发、转移分子机制，对设计靶向药物、改善肝癌患者预后及提高我国肝癌的治疗水平具有重要意义。

近年来肿瘤细胞转移过程中常出现上皮细胞间质样转变（EMT）受到关注。上皮细胞间质样转变是指具有极性的上皮细胞转换成为活动能力的间质细胞并获得侵袭和迁移能力的过程，在动物胚胎发育过程中普遍存在。当前认为90%以上的上皮细胞恶性肿瘤在发生侵袭与转移过程中发生上皮细胞间质样转变，例如乳腺癌、结肠癌、胰腺癌、肺癌、前列腺、肝癌等。上皮细胞间质样转变以上皮细胞标记缺失，如上皮型钙粘素（E-cadherin）、β连环蛋白（β-catenin）和角质蛋白18（cytokeratin 18）等及间叶组织标记的获得，如波形蛋白（Vimentin）, 神经型钙粘素（N-cadherin）和α平滑肌肌动蛋白（α-SMA）等为重要特征，涉及到多个信号转导通路和复杂的分子机制，具体包括：细胞粘附分子的表达减少；角蛋白为主的细胞骨架转变为波形蛋白为主的细胞骨架，从而引起细胞形态的改变。这种表型的转换使得肿瘤细胞容易摆脱细胞-细胞间黏附，并具有更强的穿透和游走能力，因此上皮间质样改变与肿瘤细胞的侵袭、转移关系密切。研究肿瘤上皮间质样改变的发生过程和调控机制，针对上皮间质样改变发生过程设计靶向药物对于恶性肿瘤的干预及治疗具有重要意义。

上皮间质样改变与原发性肝癌侵袭和转移的关系及其分子机制已成为目前肝癌研究的热点。这些研究常包括上皮间质样改变相关基因表达的改变引起肝癌细胞形态改变的体外研究，然后通过裸鼠接种体内验证上皮间质样改变相关基因的表达改变，最后在临床肝癌标本中证实上皮间质样变的现象。目前应用较为广泛的用于研究上皮间质样改变的动物模型是肝癌细胞皮下接种法，这种方法虽然简单易行，但与肝癌复发转移的临床生理、病理相差甚远，因此不能真实反映肝癌转移中上皮间质样改变的作用。近年来，研究者尝试用经腹盲目穿刺原位接种法制造动物模型，但这种方法具有穿刺成功率低，容易出血，腹腔播散较多等缺点。而且现有的动物模型只反映肝癌侵袭转移过程中某一时点的上皮间质样改变现象，与上皮间质样改变是一个动态的过程相违背，因此这些研究不能确切反映上皮间质样改变与肝癌侵袭转移的关系。

构建能符合肝癌转移临床特点、体现上皮间质样改变动态发生过程的肝癌原位动物模型是获得可靠结果的前提和基础。然而，目前尚缺乏这样的动物模型。

发明内容

本发明的目的在于解决肿瘤细胞侵袭转移过程中发生的上皮间质样改变难以观察的问题，开发一种简单易行、能广泛推广应用的、成功率高的、可真实模拟肝癌临床的原位移植瘤上皮间质样变动态发生过程的一种动物模型构建的方法。

为了达到上述目的，本发明提供了一种用于研究肝细胞肝癌上皮间质样变动态过程的动物模型的方法，其特征在于，取实验动物，在超声设备引导下肝脏原位接种肿瘤细胞，动态观察上皮间质样变相关指标变化以及肺转移情况。

所述的实验动物为BALB/c裸鼠。

所述的超声设备为配备有高频（5-12MHz）探头的彩色多普勒超声设备。

所述的肝脏原位接种肿瘤细胞的方法为肝实质注射肝癌细胞。

所述的动态观察上皮间质样变相关指标变化以及肺转移情况的方法为：接种后第一周开始，每隔一周处死动物，直到接种后第六周；将处死的动物解剖、取出肝脏及肺脏，脱水包埋成蜡块；将肝脏切片，免疫组织化学染色检测不同时期肝癌组织及癌旁组织中上皮间质样变相关指标变化，将肺脏连续切片，计数肺转移率和转移病灶数。

所述的免疫组织化学染色方法为链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结法（SP法）。

所述的上皮间质样变相关指标为上皮型钙粘素（E-cadherin）、神经型钙粘素（N-cadherin）、波形蛋白（Vimentin）、α平滑肌肌动蛋白（α-SMA）和Snail蛋白中的一种或几种。

所述的肺转移灶计数方法为：肺连续切片，经苏木精-伊红染色 (HE)，显微镜下观察计数肺转移率和病灶转移数。