[发明专利]复制缺陷甲病毒表达载体系统及疫苗制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种甲病毒表达载体系统及使用该表达系统制备疫苗的方法，特别涉及一种复制缺陷甲病毒表达载体系统的重组甲病毒大规模培养，并利用这一表达系统制备疫苗的方法。

背景技术

披膜病毒科中的甲病毒的核酸序列主要由两部分构成，结构蛋白和非结构蛋白序列组成。带有非结构蛋白序列复制子可以RNA的复制，并能大量扩增结构基因的亚基因组，能够大量表达替换结构基因的外源蛋白的大量表达。但是结构基因的缺失，其无法单独包装成具有感染力的病毒颗粒，也就无法再次感染细胞。利用这一特点，可以使用复制缺陷甲病毒作为外源基因表达载体。常见的甲病毒有基孔肯雅病毒(chikungunya virus, CHIKV)、辛德比斯病毒(sindbis virus，SIN)、Semliki Forest病毒(semliki Forest virus, SFV). 以及委内瑞拉马脑炎病毒(Venezuelan equine enceplitis virus，VEEV)等。

披膜病毒科中的甲病毒表达载体系统是一种成熟、安全、高效的表达系统，已广泛用于蛋白的表达、结构和功能的研究。由于该系统是一个高效的蛋白表达系统，因此也作为表达系统可以用来表达外源蛋白。其中最常用的该类病毒载体为辛德比斯病毒(sindbis virus，SIN)、Semliki Forest病毒(semliki Forest virus, SFV). 以及委内瑞拉马脑炎病毒(Venezuelan equine enceplitis virus，VEEV)等多个病毒。

甲病毒表达载体系统的主要特点为由外源抗原基因取代结构蛋白基因，但保留了“自主复制”功能，能够高水平的进行RNA复制和外源基因的表达。因此可以直接用做RNA、DNA疫苗。在甲病毒结构蛋白辅助载体帮助下，复制子DNA疫苗可以包装成重组甲病毒颗粒，其可以成为一种重组的甲病毒病毒样颗粒疫苗，它可通过和病毒感染一样的途径感染免疫细胞，从而有效地诱导机体免疫系统产生免疫保护反应。

甲病毒的核酸编码序列可分为其结构蛋白序列和非结构蛋白序列。两者的表达产物结合在一起才能包装成具有感染力的病毒。甲病毒类的结构蛋白具有一定的毒性，野生型甲病毒类结构蛋白在细胞内的表达会引起细胞自杀。

现有的甲病毒表达载体系统，一般通过分析甲病毒的序列，然后将其结构蛋白序列和非结构蛋白序列分离，进而构建甲病毒表达载体系统。使用时，一般通过共转染甲病毒复制子载体和结构蛋白辅助载体，得到子代病毒。

与常规DNA疫苗载体相比，甲病毒表达载体的基因组比较大，转染效率较低，操作较为复杂。此外，该系统的子代病毒产量不能自主复制，因此不能大量产生重组的甲病毒。

由于甲病毒类的结构蛋白具有一定的毒性，会引起载体细胞自杀，含有现阶段没有合适的用来合成甲病毒类结构蛋白的稳定互补细胞系，以辅助完成病毒的包装，也就无法得到可以稳定生产甲病毒载体系统的细胞系。所以该病毒系统用做大规模疫苗生产、蛋白表达等工业化操作，存在较大的障碍。另外同时转染甲病毒载体和结构蛋白辅助载体容易产生重组的病毒克隆，产生回复突变，而形成感染性的病毒，因此存在一定的风险，一定程度上也限制了其应用。因此，现在使用的甲病毒表达载体系统中，使用的都是减弱突变型的甲病毒，并采用特殊的细胞系，以稳定生产甲病毒载体系统。

此外，由于甲病毒复制子系统，是通过大量扩增亚基因组到达大量扩增目的基因的目的。而甲病毒复制子系统是一种正调控系统，往往会引起目的基因的过量表达，而过量表达目的基因会影响病毒结构基因的表达，从而影响重组的甲病毒的产生，导致包装出的甲病毒量较低。这在一定程度上影响了该系统的应用。

因此，现阶段缺乏操作简便，安全可靠的甲病毒表达载体系统。同样也缺乏相应的疫苗制备方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种操作简便，安全可靠的甲病毒表达载体系统。

本发明所采取的技术方案是：

复制缺陷型甲病毒表达载体系统，包括甲病毒复制子系统和甲病毒辅助包装系统，甲病毒复制子系统的复制子含有至少一个启动子和去除了编码结构蛋白序列的甲病毒核酸序列，甲病毒辅助包装系统的结构蛋白辅助子含有编码甲病毒结构蛋白序列的反义核酸序列，反义核酸序列的5’端连接有基因复制调控开关核酸序列，基因复制调控开关核酸序列的5’端连接有基因复制启动子。

结构蛋白复辅助子的甲病毒结构蛋白序列的反义核酸序列和基因复制调控开关核酸序列之间设有亚基因组增强子。