[发明专利]山羊痘病毒复制非必需区的筛选方法及其通用转移载体

权利要求书

1.一种山羊痘病毒(GTPV)复制非必需区片段的筛选方法，其包括下述步骤：

(1)根据病毒基因组某区域两端序列设计引物，以GTPV弱毒疫苗毒株AV41为材料，通过PCR扩增该区域两侧基因组片段分别作为同源重组左侧臂和右侧臂；

(2)将两侧重组臂相连，然后在两个重组臂中间插入报告基因和筛选基因的表达盒，构建转移载体质粒；

(3)将转移载体质粒与GTPVAV41株共转染原代牛睾丸细胞或者非洲绿猴肾细胞，Vero细胞，然后筛选重组GTPV；

(4)通过病毒复制效率证实所选基因组区域为GTPV的复制非必需区。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，其步骤(1)所述的基因组区域是包括病毒基因组ORF5到ORF19，即，参照Genbank登录号为NC_004003的Pellor株GTPV全基因组序列，位于2162nt～13249nt的片段；或者是包括ORF149到ORF151，即位于142573nt～145807nt的基因组片段。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，其步骤(1)所述的同源重组左侧臂是病毒基因组ORF3到ORF6，位于1281nt～2941nt，的基因组片段，同源重组右侧臂是位于12316nt～13865nt的ORF19到ORF20，的基因组片段。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，其步骤(1)所述的同源重组左侧臂还可以是病毒基因组ORF148到ORF149的基因组片段，位于141772nt～143440nt；同源重组右侧臂还可以是ORF151到ORF152的基因组片段，位于144942nt～146012nt。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，其步骤(2)所述的报告基因是EGFP基因。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，其步骤(2)所述的筛选基因是gpt基因。

7.重组GTPV的通用转移载体，其特征在于：(1)具有权利要求3和4所述的同源重组左侧臂和右侧臂；(2)筛选基因为黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(gpt)基因；(3)报告基因为绿色荧光蛋白(EGFP)基因；(4)在gpt基因侧翼含有独特的单一酶切位点Sal I，或者插入其它目的基因表达盒。

8.根据权利要求7所述的通用转移载体，其特征在于，所述的其它目的基因可以是病毒、细菌或者寄生虫的抗原基因、致病基因、肿瘤相关基因，人、畜、禽免疫调节基因以及其它动物的免疫基因。

9.重组GTPV vLF-Eg和vRF-Eg，其特征在于，由权利要求7和8所述的通用转移载体所获得；并且vLF-Eg基因组缺失了ORF5到ORF19共15个ORF，而vRF-Eg基因组缺失了ORF149到ORF151共3个ORF。