[发明专利]山羊痘病毒复制非必需区的筛选方法及其通用转移载体

说明书

技术领域

本发明涉及一种动物疫病的弱毒疫苗病毒载体的制备，更具体涉及地到制备重组山羊痘病毒所应当事先掌握的病毒复制非必需区的筛选方法以及山痘病毒通用转移载体的构建，属于生物技术领域。

背景技术

山羊痘是由山羊痘病毒(Goatpox virus，GTPV)引起的一种急性、热性、接触性传染病，病畜以发热、全身性起痘、呼吸道和消化道损伤以及淋巴结肿大为特征。该病暴发与流行不仅可给当地养羊业和农村经济造成巨大的经济损失，还严重影响着国际贸易，因此被OIE列为需要报告的疫病，也被我国列为一类动物疫病。

接种弱毒疫苗是防控山羊痘的有效手段。另外，GTPV宿主范围仅限于羊及小反刍兽，对人类和其它动物不具感染性和致病性，作为活病毒载体研制重组多价疫苗有着明显的优势。表达口蹄疫病毒、小反刍兽疫病毒等病原体保护性抗原的重组GTPV可以同时提高针对GTPV和上述病原体感染的免疫保护。因此，研制GTPV载体在防治羊及其他小反刍兽疫病方面具有广阔的应用前景，而筛选出病毒复制非必需区是构建GTPV载体的前提和基础。

AV41是目前我国广泛使用的弱毒株，免疫原性良好，具备开发疫苗载体的潜在价值。但其在对我国南方省份地方品种山羊、进口纯种羊和改良羊使用中，存在不良反应大，可引起全身发痘和孕羊流产等安全性问题，严重影响了当地山羊痘的防控工作。我国是山羊痘多发的国家，研制安全、高效的新型疫苗对于控制乃至消灭该病尤为重要。

随着DNA重组技术的发展，基因工程疫苗的研究取得了快速发展。采用基因工程技术构建的新型基因缺失(陷)山羊痘弱毒疫苗有望具有更低的毒力和更高的安全性。近年来，人们发现GTPV基因组中的胸苷激酶(TK)基因、核糖核苷酸还原酶(RR)基因和γ-干扰素受体(γ-IFN R)基因是病毒复制非必需基因，在人工缺失(陷)上述基因所获得的重组病毒不仅具有与亲本病毒基本相近的生长特性和免疫原性，而且致病性有一定程度的降低。然而，研究发现提高痘病毒活疫苗安全性最有效的方法是直接删除大段编码毒力相关基因的病毒基因组片段。例如，由Paoletti等利用痘苗病毒哥本哈根株构建的基因工程减毒株NYVAC。该毒株基因组中6条片段，包括与宿主范围相关C7L和K1L基因，以及与毒力和致病性相关的TK、HA、VGF和RR基因等16个非必需基因，均被通过分子手段精确删除。研究发现NYVAC在人细胞中复制能力显著降低，对实验动物致病力显著减弱，但仍能诱导针对外源基因和其自身良好的免疫反应，是一株十分理想的弱毒疫苗株和病毒载体。这提示我们，可以通过同时删除多个GTPV复制非必需基因，甚至大段基因组区段来达到致弱病毒的目的。2002年，GTPV全基因组序列的解析为我们借助生物信息学分析结果，通过选择性地缺失或缺陷某些基因从而获取毒力更低、安全性更好的弱毒疫苗株奠定了基础。

GTPV基因组为一个共价闭合的双链DNA，大小约149kb。其基因组至少有147个ORF，基因组中央编码区(ORF24～ORF123)主要为痘病毒家族保守基因，编码病毒复制所需的必需因子(分别参与病毒转录、RNA编辑、病毒DNA复制、病毒粒子的构建和装配等)，在基因数目和排列顺序上高度保守；而位于中央编码区两侧区域的基因(ORF1～ORF23以及ORF124～ORF156)与病毒感染的宿主范围、毒力、组织嗜性等特性有关。通过全基因组序列比对和检索，我们发现GTPV基因组左侧ORF5～ORF19共计15个ORF的编码产物基本均与GTPV调控宿主免疫应答，抑制宿主细胞凋亡等生物活性相关，其中有9个负责调节宿主的免疫反应，1个参与核酸代谢，1个调控病毒与宿主的相互作用，2个为凋亡抑制蛋白，另外还有2个ORF不完整。而位于GTPV基因组右侧的ORF149编码一个serpin样蛋白，具有抑制凋亡作用；ORF151编码一个Kelch样蛋白，具有免疫调节作用；ORF152编码一个未知功能的蛋白，与痘苗病毒A52蛋白同源。因此，我们推测GTPV ORF5～ORF19以及ORF149～ORF151两段基因组区域可能是病毒复制非必需区，能够被删除而不会明显影响病毒的存活，但却能显著降低病毒对宿主的致病力。

筛选病毒复制非必需区是构建重组山羊痘病毒的前提与基础，良好的复制非必需区不仅可使以其制备重组病毒保持良好的生长能力和免疫原性，而且能显著降低毒株的致病性从而提高其安全性。公开文献报道了一些有关山羊痘病毒载体的构建和重组山羊痘病毒的制备方法，我们经过检索文献，列出了以下的相关文献报道：