[发明专利]一种应用RAPD-PCR确定饮用水源水遗传毒性的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种确定水体遗传毒性的方法，更具体的说是一种应用RAPD-PCR确定饮用水源水遗传毒性的方法。

背景技术

遗传标记是生物遗传分析的基础和遗传分析方法。遗传标记（Genetic marker）是指那些表现变异性，且遵循简单遗传方式的性状或物质，是任何遗传分析所不可缺少的工具。它是进行遗传分析、群体遗传学研究、遗传图谱构建、基因定位以及生物进化与分类研究中不可缺少的工具。

RAPD是以PCR技术为基础的分子标记技术的一种，是1990年Williams和Welsh等各自独立地首先运用随机引物扩增寻找多态性DNA片段作为分子标记，并将这一方法命名为随机扩增多态性DNA (random amplified polymorphic DNA, RAPD)。RAPD标记技术是建立于聚合酶链式反应（PCR)基础之上，用寡核苷酸序列为引物，通过专门的PCR反应扩增获得长度不同的多态性DNA片段。不同物种的基因组中与某一引物相匹配的碱基序列的空间位置和数目都可能不同，因而扩增产物的大小和数量也可能不同，用适当选择的一系列人工合成的随机排列碱基顺序的寡聚核苷酸单链（通常为10聚体）为引物，以目标基因组DNA或RNA反转录生成的cDNA为模板进行PCR扩增。

RAPD标记技术具有以下优点：(1)无需预先知道研究对象的基因组核苷酸序列，无需专门设计的扩增引物，一套商售的引物即可满足RAPD分析的要求；(2)RAPD分析直接以基因组DNA为分析对象，无需像RFLP那样进行预备性工作—克隆制备和筛选、同位素标记、Southern印记和分子杂交等步骤，方法简便易行；(3)RAPD分析适用于自动化程序分析，结果较为准确可靠。目前， RAPD由于其自身特点而得到广泛应用，比如，在物种分类和进化和污染物的遗传毒性分析研究领域。

但是，目前RAPD在遗传毒性方面仅发挥了很小的一部分的作用，只要和合适的分析工具、严格的标准化试验条件相结合，RAPD技术将会是一种可靠、灵敏、重复性强的分析方法，并可探测出DNA的多种损伤，包括DNA加合物、DNA损伤、突变等，其在遗传毒性领域必将大有可为。

发明内容

1、本发明的目的是提供一种应用RAPD-PCR确定饮用水源水遗传毒性的方法，更好的评价饮用水源水的遗传毒性，为各类水质评价提供生物信息学参考。

2、技术方案

本发明的技术方案如下：

一种应用RAPD-PCR确定饮用水源水遗传毒性的方法，其步骤为：

（1）采用待分析饮用水源水饲喂小鼠，并分别以纯净水与一定浓度的毒性物质溶液饲喂的小鼠作为阴性对照与阳性对照；

（2）提取小鼠DNA，选用RAPD分子标记技术进行遗传分析，分别以随机引物对小鼠的肝脏细胞基因组进行RAPD扩增，并对扩增条带进行多态性分析。

步骤（2）采用电泳并拍照后获得电泳图片条带进行所述的多态性分析。

RAPD的反应体系为50ngDNA模板，10×buffer2.5μl，dNTP200μmol/L，Mg2+2.5mmol/L，引物0.8μmol/L，Taq酶2U；用灭菌双蒸水将体积补至25μl。

RAPD扩增程序为94℃预变性5min；94℃变性1min，35℃退火1min，72℃延伸2min，40个循环后72℃延伸10min。

通过以上技术方案拟解决以下问题：通过对不同处理组小鼠的遗传分析，证实水源对小鼠肝脏基因组是否存在遗传毒性及遗传毒性的大小；根据获得的基因组多态性结果，预测水源水对人类基因组的影响，并初步评价水源水的遗传毒性，为水源水的水质评价提供生物信息学参考。

3、有益效果

本发明提供了一种应用RAPD-PCR确定饮用水源水遗传毒性的方法，可以确定饮用水源水对小鼠基因组DNA的影响，从整体评价和预警其可能产生的遗传毒性，同时，证实了RAPD技术在遗传毒性研究领域应用的优越性和可行性。本发明为饮用水源水的质量控制以及沿岸治理提供依据。

附图说明

图1为部分引物扩增得到的RAPD图谱，其中A:水源水组，B：CK组，C：Bap组，O：空白组（以灭菌双蒸水代替DNA模板所配成的体系）。

图2为UPGMA法对9只小鼠进行聚类分析。

图3 为UPGMA法对Nei’s遗传距离分类聚态图。

具体实施方式

以下通过实施例进一步说明本发明。

1 实验设计

本实验采用雄性小鼠(Mus musculus, ICR)作为实验对象，小鼠3～4周龄，体重18 ± 1g。