[发明专利]RT-LAMP检测方法在快速检测丙型肝炎病毒载量中的应用无效
| 申请号： | 201110045349.3 | 申请日： | 2011-02-25 |
| 公开（公告）号： | CN102649981A | 公开（公告）日： | 2012-08-29 |
| 发明（设计）人： | 李擎天;熊慧;金维荣;郭晓奎;王颖 | 申请（专利权）人： | 上海交通大学医学院 |
| 主分类号： | C12Q1/70 | 分类号： | C12Q1/70;C12Q1/68 |
| 代理公司： | 上海翼胜专利商标事务所(普通合伙) 31218 | 代理人： | 翟羽 |
| 地址： | 200025 *** | 国省代码： | 上海;31 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | rt lamp 检测 方法 快速 肝炎 病毒 中的 应用 | ||
1.RT-LAMP检测方法在快速检测丙型肝炎病毒载量中的应用，包括以下步骤：
（1）选取HCV的特异性基因片段用于LAMP扩增；（2）用于HCV基因扩增的结果判断；其特征在于，
步骤（1）中用于HCV基因扩增的特异性引物为：
F3：GCAGAAAGCGTCTAGCCA；
B3：CTCGCAAGCACCCTATCA；
FIP：TACTCACCGGTTCCGCAGTTTTTGCAGCCTCCAGGACCCC；
BIP：TGGAGATTTGGGCGTGCCTTTTTGCCTTTCGCGACCCAACA；
用于HCV基因扩增的体系为二步法或者一步法；
步骤（2）中在检测时使用Sybgreen染液实时观察，加入梯度浓度的标准品以及阴性血清对照，在紫外灯下每5分钟对标准品、对照及待测样本直接观察，即可获得待测样本的HCV载量。
2. 根据权利要求1所述的RT-LAMP检测方法在快速检测丙型肝炎病毒载量中的应用，其特征在于，所述二步法第一步反转录的体系为：总体积20μl；其中10×AMV缓冲液2μl，HCV RNA模板2μl，AMV酶1μl，dNTP 2μl，其中dATP、dTTP、dCTP、dGTP浓度各10 mM，引物B3 1μl，补足DNAse、RNAse酶Free水至20μl；
二步法第一步反转录的反应条件为：50℃，反应30分钟；
二步法第二步扩增的体系为：总体积20μl；其中10×Bst DNA pol大片段缓冲液2μl，第一步反转录的产物2μl，Bst DNA pol大片段1μl，dNTP 4μl，其中dATP、dTTP、dCTP、dGTP浓度各10 mM，引物F3、B3各0.5μl，引物FIP、BIP各2μl，100×Sybgreen 2μl，补足DNAse、RNAse酶Free水至20μl；
二步法第二步扩增的反应条件为：62℃，反应60-80分钟，每5分钟在紫外灯下观察一次结果。
3. 根据权利要求1所述的RT-LAMP检测方法在快速检测丙型肝炎病毒载量中的应用，其特征在于，所述一步法的体系为：总体积20μl；其中10×Bst DNA pol大片段缓冲液2μl，HCV RNA模板2μl，AMV酶1μl，Bst DNA pol大片段1μl，dNTP 4μl，其中dATP、dTTP、dCTP、dGTP浓度各10 mM，引物F3、B3各0.5μl，引物FIP、BIP各2μl，100×Sybgreen 2μl，补足DNAse、RNAse酶Free水至20μl；
一步法的反应条件为：50℃，反应20分钟；62℃，反应60-80分钟，每5分钟在紫外灯下观察一次结果。
4. 根据权利要求1所述的RT-LAMP检测方法在快速检测丙型肝炎病毒载量中的应用，其特征在于，LAMP扩增的温度为60℃-65℃。
5. 根据权利要求4所述的RT-LAMP检测方法在快速检测丙型肝炎病毒载量中的应用，其特征在于，LAMP扩增的温度为62℃。
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