[发明专利]RT-LAMP检测方法在快速检测丙型肝炎病毒载量中的应用

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术与医学领域，更具体的说，涉及RT-LAMP恒温基因扩增的方法在快速检测人体血浆/清或其他体液中丙型肝炎病毒（hepatitis C virus，HCV）的有无以及半定量检测中的应用。

背景技术

环介导等温扩增技术(Loop—mediated isothermal amplifieation，LAMP)是2000年Notomi等发明的体外等温扩增特异核酸片段的技术。该技术利用针对基因序列中6个特异性片段的两对特殊引物和有链置换活性的Bst（Bacillus stearotherrnophilus) DNA聚合酶，使模板两端引物结合处循环出现环状单链结构，在60-65℃恒温条件下使引物与模板结合并进行链置换扩增反应。LAMP可以在60 分钟内扩增出10⁹～10¹⁰倍靶序列拷贝，结果可用直观的荧光或电泳检测，也可用焦磷酸镁浊度法检测。环介导等温扩增技术起始于DNA的扩增，适用于DNA基因组的检测。随后，检测RNA基因组的反转录-环介导扩增技术也被提出，即是在LAMP扩增之前加上反转录步骤。目前，已有甲型流感病毒、猪瘟病毒等多种RNA病毒的RT-LAMP扩增方法被提出。

丙型肝炎是由丙型肝炎病毒HCV引起的严重危害健康的感染性疾病。目前，对于HCV的检测主要依靠免疫学方法即抗体的检测，这种方法实际检测的是被感染者对于感染的免疫反应情况。对于HCV载量的检测，目前主要依赖Realtime-PCR技术，该技术需要定量PCR仪等昂贵设备，难以在基层及现场开展。

将RT-LAMP技术用于HCV的测定已有相关报道，目前技术方法的结果判断有实时法和终点法，实时法需要使用定量PCR仪；终点法主要面临非特异扩增的问题。

现有的HCV载量检测技术的主要不足是：能够实现较精确定量的Realtime-PCR等方法仪器设备要求、人员操作要求高；而现有的RT-LAMP方法主要是以终点法进行检测，无法实现对于HCV载量的定量，且对于体系污染等假阳性缺乏监测，影响了这些方法的实际应用。

发明内容

本发明的目的在于提供RT-LAMP检测方法在快速检测丙型肝炎病毒载量中的应用，可以实现人体血浆/清或其他体液中丙型肝炎病毒的快速半定量和定性检测。

为实现以上目的，本发明公开以下技术方案：RT-LAMP检测方法在快速检测丙型肝炎病毒载量中的应用，包括以下步骤：

（1）选取HCV的特异性基因片段用于LAMP扩增；（2）用于HCV基因扩增的结果判断；步骤（1）中用于HCV基因扩增的特异性引物为：

F3：GCAGAAAGCGTCTAGCCA；

B3：CTCGCAAGCACCCTATCA；

FIP：TACTCACCGGTTCCGCAGTTTTTGCAGCCTCCAGGACCCC；

BIP：TGGAGATTTGGGCGTGCCTTTTTGCCTTTCGCGACCCAACA；

用于HCV基因扩增的体系为二步法或者一步法；

步骤（2）中在检测时使用Sybgreen染液实时观察，加入梯度浓度的标准品以及阴性血清对照，在紫外灯下每5分钟对标准品、对照及待测样本直接观察，即可获得待测样本的HCV载量。

所述二步法第一步反转录的体系为：总体积20μl；其中10×AMV缓冲液2μl，HCV RNA模板2μl，AMV酶1μl，dNTP 2μl，其中dATP、dTTP、dCTP、dGTP浓度各10 mM，引物B3 1μl，补足DNAse、RNAse酶Free水至20μl；

二步法第一步反转录的反应条件为：50℃ 30分钟；

二步法第二步扩增的体系为：总体积20μl；其中10×Bst DNA pol大片段缓冲液2μl，第一步反转录的产物2μl，Bst DNA pol大片段1μl，dNTP 4μl，其中dATP、dTTP、dCTP、dGTP浓度各10 mM，引物F3、B3各0.5μl，引物FIP、BIP各2μl，100×Sybgreen 2μl，补足DNAse、RNAse酶Free水至20μl；

二步法第二步扩增的反应条件为：62℃ 60-80分钟，每5分钟在紫外灯下观察一次结果。