[发明专利]一种酯型儿茶素合成酶的活性检测方法

权利要求书

1.一种酯型儿茶素合成酶的活性检测方法，其特征在于包括以下操作步骤：

1.1、酶液制备

取2克茶树鲜叶，加入液氮，快速研磨成粉末状，再加入2克聚乙烯吡咯烷酮(PVPP)、0.5克石英砂、18mL预冷的0.1 mol/L pH 7.4的磷酸缓冲液溶液和2mL 20mmol/L的抗坏血酸溶液，4℃条件下研磨成匀浆，在离心机转速12000转/分钟、温度4℃条件下，离心分离15 分钟，取上清液，即得浓度1.2mg/mL的酶液；

1.2、酶活性的测定

1.2.1、反应液的制备

总体积为1.5mL的反应液包括下列原料：

酶液： 1.2mg/mL的酶液

抗氧化剂：20 mmol/L的抗坏血酸溶液

水解抑制剂：30.4 mmol/L的水杨酸溶液

反应底物：3.8 mmol/L的表没食子儿茶素溶液或3.8 mmol/L的表儿茶素溶液、

9.6 mmol/L的1-O-没食子酰-β-D-葡萄糖溶液

缓冲液：0.1 mol/L 、pH=6.0的磷酸缓冲液

将0.46mL酶液、0.3mL抗氧化剂、0.074mL水解抑制剂、0.15mL反应底物表儿茶素溶液或0.15mL表没食子儿茶素、溶液0.075mL反应底物1-O-没食子酰-β-D-葡萄糖溶液和0.59mL磷酸缓冲液混合均匀，温度30℃水浴反应60分钟，得反应液；

1.2.2、对照液的制备

反应液包括下列原料：

酶液：温度100℃煮沸5分钟的酶液

抗氧化剂：20 mmol/L的抗坏血酸溶液

水解抑制剂：30.4 mmol/L的水杨酸溶液

反应底物：3.8 mmol/L的表没食子儿茶素溶液或3.8 mmol/L的表儿茶素溶液、

9.6 mmol/L的1-O-没食子酰-β-D-葡萄糖溶液

缓冲液：  0.1 mol/L、pH=6.0的磷酸缓冲液

将0.46mL的温度100℃煮沸5分钟的酶液、0.3mL抗氧化剂、0.074mL水解抑制剂、0.15mL反应底物表没食子儿茶素溶液或0.15mL表儿茶素溶液、0.075mL反应底物1-O-没食子酰-β-D-葡萄糖溶液和0.59mL磷酸缓冲液混合均匀，温度30℃水浴反应60分钟，得对照液；

 1.2.3、反应甲醇液和对照甲醇液的制备

在反应液和对照液中，分别加入3mL乙酸乙酯，分别在室温下萃取反应产物，重复萃取三次，分别收集合并反应液的乙酸乙酯相和对照液的乙酸乙酯相；将反应液的乙酸乙酯相和对照液的乙酸乙酯相，分别60℃减压浓缩10分钟，分别用甲醇溶解并定容至500微升，分别得到反应甲醇液和对照甲醇液；

1.2.4、酶反应产物的高效液相色谱分析

采用高效液相色谱技术分别检测反应甲醇液和对照甲醇液中表没食子儿茶素没食子酸酯或表儿茶素没食子酸酯的含量；在反应甲醇液中检测到表没食子儿茶素没食子酸酯或表儿茶素没食子酸酯，而在对照甲醇液中检测不到表没食子儿茶素没食子酸酯或表儿茶素没食子酸酯，即可以证明检测到茶鲜叶中的酯型儿茶素合成酶酶活。

2.根据权利要求1所述的一种酯型儿茶素合成酶的活性检测方法，其特征在于：

利用酶活计算方法，计算酯型儿茶素合成酶活力，即以在30℃下每分钟每毫克酶催化形成的酶产物表没食子儿茶素没食子酸酯或表儿茶素没食子酸酯的量，单位为mg/分钟/毫克蛋白；

酯型儿茶素合成酶酶活=△m/60分钟/0.55毫克蛋白，

上式中：△m表示60分钟内形成的酶产物表没食子儿茶素没食子酸酯或表儿茶素没食子酸酯的量；60分钟表示酶反应60分钟；0.55毫克蛋白表示1.5mL反应液中加入酶含量。