[发明专利]一种酯型儿茶素合成酶的活性检测方法

说明书

技术领域

本发明属于生物材料检测技术领域，具体涉及一种酯型儿茶素合成酶的活性检测方法。

背景技术

茶树中酯型儿茶素主要有表儿茶素没食子酸酯(ECG)和表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)，非酯型儿茶素主要有表儿茶素(EC)和表没食子儿茶素(EGC)；结构上,酯型儿茶素(表儿茶素没食子酸酯(ECG)和表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG))是在非酯型儿茶素(表儿茶素(EC)、表没食子儿茶素(EGC))结构的3-OH位置上和没食子酸(GA)形成的酸酯。

茶树中酯型儿茶素含量较高，为茶多酚总量的55％左右，为鲜叶干物重的12％-19％^[1]。酯型儿茶素比非酯型儿茶素具有更强的药用价值^[2-3]，酯型儿茶素具有抗氧化、抗菌、抗炎、抗癌等多种药理活性，对帕金森疾病也有一点的疗效^[4]。除此之外，酯型儿茶素还是决定茶叶饮料品质的关键因子之一^[5]。

酯型儿茶素人工合成难度较大，茶叶依旧是酯型儿茶素的主要来源^[5]。植物体内的非酯型儿茶素的生物合成途径较为清晰，涉及的主要催化酶有二氢黄酮醇 4-还原酶、无色花色素还原酶、花青素合成酶、花青素还原酶等^[6-8]。酯型儿茶素合成是类黄酮生物合成途径中的关键一环，而酯型儿茶素生物合成途径一直是的未解之谜^[9]。本申请人首次利用薄层层析(TLC)、高效液相色谱(HPLC)和质谱(MS)技术，从茶树中鉴定了一种能催化酯型儿茶素合成的酶类(epicatechin:1-O-galloyl- -D-glucose O-galloyltransferase，ECGT)，在它的催化下, 1-O-没食子酰-β-D-葡萄糖(βG)和非酯型儿茶素(表儿茶素 (EC)或表没食子儿茶素 (EGC))反应形成相应的酯型儿茶素(表儿茶素没食子酸酯(ECG)或表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG))。本申请人利用硫酸铵分级沉淀、阴离子交换和凝胶过滤层析对该酶进行了初步纯化。迄今为止，尚无酯型儿茶素合成酶的酶活检测方法的文献报道。

发明内容

在首次发现并鉴定茶树酯型儿茶素合成酶存在的基础上，本发明提供一种酯型儿茶素合成酶的活性检测方法。

实现上述的目的的技术解决方案如下：

一种酯型儿茶素合成酶的活性检测方法包括以下操作步骤：

1.1、酶液制备

取2克茶树鲜叶，加入液氮，快速研磨成粉末状，再加入2克聚乙烯吡咯烷酮(PVPP)、0.5克石英砂、18mL预冷的0.1 mol/L pH 7.4的磷酸缓冲液溶液和2mL 20mmol/L的抗坏血酸溶液，4℃条件下研磨成匀浆，在离心机转速12000转/分钟、温度4℃条件下，离心分离15 分钟，取上清液，即得浓度1.2mg/mL的酶液；

1.2、酶活性的测定

1.2.1、反应液的制备

总体积为1.5mL的反应液包括下列原料：

酶液： 1.2mg/mL的酶液、

抗氧化剂：20 mmol/L的抗坏血酸溶液、

水解抑制剂：30.4 mmol/L的水杨酸溶液、

反应底物：3.8 mmol/L的表没食子儿茶素(EGC)溶液或3.8 mmol/L的表儿茶素(EC)溶液、

9.6 mmol/L的1-O-没食子酰-β-D-葡萄糖(βG)溶液、

缓冲液：0.1 mol/L 、pH=6.0的磷酸缓冲液，

将0.46mL酶液、0.3mL抗氧化剂、0.074mL水解抑制剂、0.15mL反应底物表儿茶素(EC)溶液或0.15mL表没食子儿茶素(EGC)、溶液0.075mL反应底物1-O-没食子酰-β-D-葡萄糖(βG)溶液和0.59mL磷酸缓冲液混合均匀，温度30℃水浴反应60分钟，得反应液；

1.2.2、对照液的制备

反应液包括下列原料：

酶液：温度100℃煮沸5分钟的酶液、

抗氧化剂：20 mmol/L的抗坏血酸溶液、

水解抑制剂：30.4 mmol/L的水杨酸溶液、

反应底物：3.8 mmol/L的表没食子儿茶素(EGC)溶液或3.8 mmol/L的表儿茶素(EC)溶液、

9.6 mmol/L的1-O-没食子酰-β-D-葡萄糖(βG)溶液、

缓冲液：  0.1 mol/L、pH=6.0的磷酸缓冲液；