[发明专利]检测鸭瘟病毒抗体的UL55重组原核表达蛋白及制备方法

权利要求书

1.一种检测鸭瘟病毒抗体的重组原核表达蛋白，其特征在于：该检测鸭瘟病毒抗体的重组原核表达蛋白由SEQ ID NO：2的氨基酸序列表定义；是SEQ ID NO：1核苷酸序列的原核表达产物。

2.一种检测鸭瘟病毒抗体的原核表达蛋白的制备方法，其特征在于，包括：

(1)设计扩增DPV-UL55基因的特异性引物；

(2)通过PCR扩增获得UL55基因片段；

(3)对UL55基因进行克隆、测序鉴定；

(4)将UL55基因定向亚克隆至pET32a原核表达载体；

(5)UL55基因在大肠杆菌中的诱导表达；

将重组表达质粒pET32a-UL55转化宿主菌大肠杆菌BL21(DE3)中进行诱导表达；

(6)UL55基因表达蛋白的纯化；

(7)重组UL55蛋白的复性和检测。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(6)具体做法为：

①待纯化样的制备

离心收集表达菌液：收集诱导表达的菌液离心取沉淀，将菌体沉淀用20mmolTris-HCl(pH8.0)悬浮，直接进行包涵体洗涤法纯化重组ULL55蛋白的或-20℃保存备用；

②重组ULL55蛋白的包涵体洗涤法纯化

取出离心收集并用20mmolTris-HCl(pH8.0)悬浮的表达菌(-20℃保存的菌体沉淀，室温下融化后)，超声波(冰浴)间歇破碎菌体(200w，30sec/次，5～10次)，4℃10000r/min离心10min。将沉淀用20ml洗液(10mmol/L PBS+2mol/L尿素+1％Triton X-100+20mMTris-HCl+2mM EDTA)悬浮，4℃10000r/min离心10min后，沉淀再次用20ml洗液悬浮，重复洗涤五次后，用适量尿素溶液(10mmol/L PBS+8M尿素+50mM Tris-HCl+50mMNaCl+10％甘油)溶解沉淀，4℃保存备用。

4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(7)具体做法为：将包涵体洗涤纯化得到的重组UL55蛋白分多次加入到复性缓冲液(50mM Tris-HCl pH8.0+0.15M NaCl+1mM EDTA+1mM GSSG+10mM GSSH)中，使尿素浓度按6M、5M、4M、3M、2M逐步降低，使变性蛋白逐渐复性，并控制蛋白终浓度在0.1～1mg/ml的范围内。4℃复性24～48h，收集稀释复性的蛋白液，装入透析袋4℃透析(透析缓冲液：50mMTris-HCl pH 8.0+50mM NaCl+0.5mM EDTA+10％甘油+1％甘氨酸)24～48h。透析后样品经8000g离心15min后收集上清，取其中20μl进行SDS-PAGE分析，并以纯化的的兔抗DPV为一抗，以HRP标记羊抗兔IgG为二抗进行Western blotting检测。其余蛋白液用Bradford法测定蛋白的最终浓度，分装后冷冻干燥浓缩备用。