[发明专利]检测鸭瘟病毒抗体的UL55重组原核表达蛋白及制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及动物医学领域，涉及一种基因工程制品和其制备方法。具体地说是一种应用基因工程技术制备检测鸭瘟抗体的DPV-UL55基因重组原核表达检测抗原蛋白及其制备方法。

背景技术

鸭瘟(duck plague，DP)是由疱疹病毒科中的DPV引起的常见于鸭、鹅、天鹅等水禽的一种高度致死性传染病。鸭瘟自上世纪20年代首先在荷兰被发现以来，已有80多年的历史了。该病在世界各养鸭地区都有分布，给世界各国的水禽养殖业造成了巨大的经济损失。其预防和控制已直接关系到水禽养殖业的持续稳定发展。

临床和实验室试验证实DPV弱毒疫苗是预防控制DP的有效生物制剂，而对DPV特异性抗体的监测是评价DPV弱毒疫苗免疫效果及制定合理的免疫程序的关键。目前，用于检测DPV抗体的方法大多是基于DPV全病毒作为抗原的检测方法。但其存在以下不足：一是在操作过程中不可避免造成散毒；二是由于DPV全病毒作为诊断抗原其制备的复杂性以及纯度不够理想使其不易推广。阻碍了以全病毒作为诊断抗原监测DPV抗体的大规模应用。利用原核表达系统生产的一些基因工程蛋白可以保持必要的抗原性，而且其制备和纯化过程相对简单，能够用于病毒感染抗体的检测。因此研究和应用DPV UL55基因原核表达产物对于DPV预防和控制具有重要的理论和临床意义。

发明内容

本发明提供一种DPV UL55基因原核表达蛋白及其制备方法。其目的在于提供一种无散毒危险、稳定性好、灵敏度高、可实现工业化生产、成本低，制备方法简单易于推广的检测鸭瘟病毒抗体的原核表达检测抗原及其制备方法。

本发明的目的是这样实现的：

一种检测鸭瘟病毒抗体的重组原核表达蛋白，该检测鸭瘟病毒抗体的重组原核表达蛋白由SEQ ID NO：2的氨基酸序列表定义；是SEQ ID NO：1核苷酸序列的原核表达产物。

一种检测鸭瘟病毒抗体的原核表达蛋白的制备方法，包括以下步骤：

(1)设计扩增DPV-UL55基因的特异性引物；

(2)通过PCR扩增获得UL55基因片段；

(3)对UL55基因进行克隆、测序鉴定；

(4)将UL55基因定向亚克隆至pET32a原核表达载体；

(5)UL55基因在大肠杆菌中的诱导表达；

将重组表达质粒pET32a-UL55转化宿主菌大肠杆菌BL21(DE3)中进行诱导表达；

(6)UL55基因表达蛋白的纯化；

(7)重组UL55蛋白的复性和检测。

所述的制备方法，步骤(6)具体做法为：

①待纯化样的制备

离心收集表达菌液：收集诱导表达的菌液离心取沉淀，将菌体沉淀用20mmolTris-HCl(pH8.0)悬浮，直接进行包涵体洗涤法纯化重组ULL55蛋白的或-20℃保存备用。

②重组ULL55蛋白的包涵体洗涤法纯化

取出离心收集并用20mmolTris-HCl(pH8.0)悬浮的表达菌(-20℃保存的菌体沉淀，室温下融化)，超声波(冰浴)间歇破碎菌体(200w，30sec/次，5～10次)，4℃10000r/min离心10min。将沉淀用20ml洗液(10mmol/L PBS+2mol/L尿素+1％Triton X-100+20mMTris-HCl+2mM EDTA)悬浮，4℃10000r/min离心10min后，沉淀再次用20ml洗液悬浮，重复洗涤五次后，用适量尿素溶液(10mmol/L PBS+8M尿素+50mM Tris-HCl+50mMNaCl+10％甘油)溶解沉淀，4℃保存备用。

所述的制备方法，步骤(7)具体做法为：将包涵体洗涤纯化得到的重组UL55蛋白分多次加入到复性缓冲液(50mM Tris-HCl pH 8.0+0.15M NaCl+1mM EDTA+1mMGSSG+10mM GSSH)中，使尿素浓度按6M、5M、4M、3M、2M逐步降低，使变性蛋白逐渐复性，并控制蛋白终浓度在0.1～1mg/ml的范围内。4℃复性24～48h，收集稀释复性的蛋白液，装入透析袋4℃透析(透析缓冲液：50mM Tris-HCl pH 8.0+50mM NaCl+0.5mMEDTA+10％甘油+1％甘氨酸)24～48h。透析后样品经8000g离心15min后收集上清，取其中20μl进行SDS-PAGE分析，并以纯化的的兔抗DPV为一抗，以HRP标记羊抗兔IgG为二抗进行Western blotting检测。其余蛋白液用Bradford法测定蛋白的最终浓度，分装后冷冻干燥浓缩备用。