[发明专利]制备两端带有限制性内切酶粘性末端的目的DNA片段的方法

权利要求书

1.一种制备两端带有限制性内切酶粘性末端的双链DNA片段的方法，包括如下步骤：

(1)制备引物对甲和引物对乙；所述引物对甲由上游引物甲和下游引物甲组成；所述引物对乙由上游引物乙和下游引物乙组成；所述引物对甲和所述引物对乙用于扩增同一目的DNA片段；所述上游引物甲的5′末端具有限制性内切酶甲识别序列中切割位点下游的全部序列；所述下游引物甲的5′末端具有限制性内切酶乙识别序列中切割位点上游的全部序列的反向互补序列；所述上游引物乙的5′末端具有所述限制性内切酶甲识别序列中切割位点上游的全部序列的反向互补序列；所述下游引物乙的5′末端具有所述限制性内切酶乙识别序列中切割位点下游的全部序列；

(2)用所述引物对甲PCR扩增所述目的DNA片段，得到PCR扩增产物甲；用所述引物对乙PCR扩增所述目的DNA片段，得到PCR扩增产物乙；

(3)将所述PCR扩增产物甲和所述PCR扩增产物乙混合后依次进行变性和退火，得到5′末端带有限制性内切酶甲识别序列的粘性末端且3′末端带有限制性内切酶乙识别序列的粘性末端的双链DNA片段。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(3)中，所述PCR扩增产物甲和所述PCR扩增产物乙等摩尔混合。

3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述限制性内切酶甲的切割位点位于所述限制性内切酶甲的识别序列内；所述限制性内切酶乙的切割位点位于所述限制性内切酶乙的识别序列内。

4.权利要求1或2或3所述方法在构建重组载体中的应用。

5.一种制备重组载体的方法，包括如下步骤：

(1)用权利要求1所述限制性内切酶甲和权利要求1所述限制性内切酶乙酶切出发质粒，回收载体骨架；所述出发质粒中含有权利要求1所述限制性内切酶甲的识别序列和权利要求1所述限制性内切酶乙的识别序列；

(2)将用权利要求1或2或3所述方法制备的5′末端带有限制性内切酶甲识别序列的粘性末端且3′末端带有限制性内切酶乙识别序列的粘性末端的双链DNA片段与步骤(1)得到的载体骨架连接，得到重组载体。

6.引物对甲和引物对乙组成的引物组合物；所述引物对甲和所述引物对乙用于扩增同一目的DNA片段；所述上游引物甲的5′末端具有限制性内切酶甲识别序列中切割位点下游的全部序列；所述下游引物甲的5′末端具有限制性内切酶乙识别序列中切割位点上游的全部序列的反向互补序列；所述上游引物乙的5′末端具有所述限制性内切酶甲识别序列中切割位点上游的全部序列的反向互补序列；所述下游引物乙的5′末端具有所述限制性内切酶乙识别序列中切割位点下游的全部序列。