[发明专利]制备两端带有限制性内切酶粘性末端的目的DNA片段的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种制备两端带有限制性内切酶粘性末端的目的DNA片段的方法。

背景技术

自PCR技术问世以来，适应PCR产物测序、改造和表达等需要，先后出现了多种克隆方法，包括在引物中引入完整酶切位点克隆法[Scharf S.J.，Horn G.T.& ErlichH.A.(1986)Direct cloning and sequence analysis of enzymatically amplifiedgenomic sequences.Science，233，1076-1078.]、无需连接反应的克隆方法[Aslanidis C.& de Jong P.J.(1990)Ligation-independent cloning of PCRproducts(LIC-PCR).Nucleic Acids Res.，18(20)：6069-6074.]、T载体克隆法[Marchuk D.，Drumm M.，Saulino A.& Collins F.S.(1991)Construction ofT-vectors，a rapid and general system for direct cloning of unmodified PCRproducts.Nucleic Acids Res.19(5)：1154.]、平末端连接法[Liu Z.G.& SchwartzL.M.(1992)An efficient method for blunt-end ligation of PCR products.Biotechniques.12(1)：28，30.]、Hetero-stagger克隆技术[Liu Z.(1996)Hetero-stagger cloning：efficient and rapid cloning of PCR products.NucleicAcids Res.24(12)：2458-2459.]、autosticky PCR技术[Gál J.，Schnell R.，SzekeresS.& Kálmán M.(1999)Directional cloning of native PCR products with preformedsticky ends(autosticky PCR).Mol Gen Genet.260(6)：569-573.]、无酶克隆法[Tillett D.& Neilan B.A.(1999)Enzyme-free cloning：a rapid method to clonePCR products independent of vector restriction enzyme sites.Nucleic Acids Res.27(19)：e26.]、嵌合引物克隆法[Chen G.J.，Qiu N.& Page M.P.(2002)Universalrestriction site-free cloning method using chimeric primers.Biotechniques.32(3)：516，518-520.]、3GC克隆技术[Zheng D.，Liu X.& Zhou Y.(2008)3GC cloning：PCR products cloning mediated by terminal deoxynucleotidyl transferase.AnalBiochem.378(1)：108-110.]等。这些方法各具特色，但也均存在各种局限性。

以第一种克隆方法为例，该方法最早被用于PCR产物的克隆，目前仍然是最流行的一种克隆技术。该方法存在两个明显缺陷：首先，多种II型限制性DNA内切酶对位于DNA末端的识别位点切割效率很低，需要在引物的5’端添加较长的保护碱基才能有效切割PCR产物，但添加过长的保护碱基可能会影响PCR扩增效果；其次，插入片段内含的限制酶位点会影响克隆位点的选择，一些较长的PCR产物可能会含有较多种限制酶位点，不能方便地连接到载体中，实验人员为克隆不同的PCR产物往往需要准备多种不同的内切酶，增加了克隆的难度和费用。