[发明专利]大肠杆菌O157:H7双重PCR快速检测方法及试剂盒

权利要求书

1.一种大肠杆菌O157:H7双重PCR快速检测方法，通过双重PCR反应后，经电泳、染色、漂洗、紫外鉴定，其特征在于该方法能同时检出O157和H7基因，其引物序列和扩增序列分别为：

引物rfbE-F序列 5’-TGT CCA TTT ATA CGG ACA TCC ATG-3’

引物rfbE-R序列 5’-CCT ATA ACG TCA TGC CAA ATT GCC-3’

rfbE扩增序列为序列表SEQ.ID.No.3的碱基序列。

引物Flic-F序列 5’-GCG AAG TTA AAC ACC ACG AC-3’

引物Flic-R序列 5’-ACC CGT ACC AGC AGT AGA TT-3’

Flic扩增序列为序列表SEQ.ID.No.6的碱基序列。

2.根据权利要求1所述的大肠杆菌O157:H7双重PCR快速检测方法，其特征在于所述方法包括如下步骤：

<1>制备DNA样本：采用直接加入法；

<2>双重PCR反应：取步骤<1>所得DNA样本作为模板进行PCR扩增，并同时分别以标准品DNA和去离子水为阳性对照样本和阴性对照样本进行PCR扩增；

PCR反应结束后，取PCR反应液进行琼脂糖凝胶电泳，然后EB染色，漂洗，在紫外透射仪下观察结果。

3.根据权利要求2所述的大肠杆菌O157:H7双重PCR快速检测方法，其特征在于所述PCR反应的反应体系和扩增程序分别为：

反应体系：PCR混合液25μL，其中10×PCR缓冲液2.5μL、25mM MgCl₂4μL、dNTPs1μL、引物rfbE-F和rfbE-R各1.5μL、引物Flic-F和Flic-R各1μL、待检样本3μL及去离子水9.5μL。

扩增程序：95℃5min；随后进行35个循环，每个循环包括95℃20s，60℃20s，72℃20s；最后72℃3min，于4℃停止反应。

4.根据权利要求1所述的大肠杆菌O157:H7双重PCR快速检测方法的试剂盒，其特征在于该试剂盒含有以下试剂：

A液：PCR反应液，含10×PCR缓冲液、MgCl₂、dNTPs和上下游引物；

B液：含大肠杆菌O157:H7细菌DNA，作为阳性对照，；

C液：去离子水，作为阴性对照。

5.根据权利要求4所述的大肠杆菌O157:H7双重PCR快速检测方法的试剂盒，其特征在于所述PCR反应液为每管25μL PCR反应体系中含10×PCR缓冲液2.5μL、25mM MgCl₂4μL、dNTPs 1μL、引物rfbE-F和rfbE-R各1.5μL、引物Flic-F和Flic-R各1μL，去离子水9.5μL。

6.根据权利要求4或5所述的大肠杆菌O157:H7双重PCR快速检测方法的试剂盒，其特征在于该试剂盒含有PCR反应管。