[发明专利]大肠杆菌O157:H7双重PCR快速检测方法及试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及大肠杆菌O157:H7的检测技术，尤其涉及大肠杆菌O157:H7双重PCR快速检测方法及试剂盒。

背景技术

大肠杆菌O157:H7(E.coli O157:H7)是一种人畜共患的食源性致病菌，具有广泛流行性和对人类的高致病性，其感染力强(100～200个细菌即可引起感染，而其他致病性大肠杆菌需要百万个细菌以上才能引起发病)，可通过牛、猪、鸡等多种家畜禽宿主动物感染人类并在人类中流行，感染人可引起腹泻、出血性结肠炎，溶血性尿毒综合症及血栓性血小板减少等，严重者可导致死亡。因此，快速准确的检测大肠杆菌O157:H7是控制由其引起的食物中毒或感染暴发与流行的关键。

目前大肠杆菌O157:H7的实验室诊断方法多为选择性培养基-山梨醇麦康凯培养基分离法和抗血清鉴定法，但两者都存在耗时长和假阳性的问题。研究表明，大肠杆菌O157:H7与非H7血清型在山梨醇麦康凯培养基上均为白色半透明菌落，生化特性相似，用选择性培养基无法区分；另外，对大肠杆菌O157:H7与非H7血清型细菌的鞭毛基因(Flic)的序列比对表明，其核苷酸同源性在70％左右，存在抗原交叉，应用H7单因子血清凝集反应不易区分。李丽等人对大肠杆菌O157:H7多重PCR检测进行了研究(李丽.大肠杆菌O157:H7多重PCR检测和溶血素蛋白的表达及其免疫原性分析[D].南京农业大学2009：21-32)，并建立了以O157抗原基因rfbE和H7标志性基因Flic为靶基因的二重PCR检测方法，然而，由于需要提取细菌DNA及扩增片段过长(812bp和609bp)，处理和检测时间较长操作费时；而且，该研究未涵盖大肠杆菌O157非H7血清型，不能排除前述核苷酸同源性导致假阳性的可能，即此方法的特异性存在疑问。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种快速、灵敏、准确的大肠杆菌O157:H7双重PCR快速检测方法及试剂盒。

为解决上述技术问题本发明采用如下技术方案：

大肠杆菌O157:H7双重PCR快速检测方法，通过双重PCR反应后，经电泳、染色、漂洗、紫外鉴定，该方法能同时检出O157和H7基因，其引物序列和扩增序列分别为：

引物rfbE-F序列 5’-TGT CCA TTT ATA CGG ACA TCC ATG-3’

引物rfbE-R序列 5’-CCT ATA ACG TCA TGC CAA ATT GCC-3’

rfbE扩增序列为序列表SEQ.ID.No.3的碱基序列。

引物Flic-F序列 5’-GCG AAG TTA AAC ACC ACG AC-3’

引物Flic-R序列 5’-ACC CGT ACC AGC AGT AGA TT-3’

Flic扩增序列为序列表SEQ.ID.No.6的碱基序列。

上述方法包括如下步骤：

<1>制备DNA样本：采用直接加入法；

<2>双重PCR反应：取步骤<1>所得DNA样本作为模板进行PCR扩增，并同时分别以标准品DNA和去离子水为阳性对照样本和阴性对照样本进行PCR扩增；

PCR反应结束后，取PCR反应液进行琼脂糖凝胶电泳，然后EB染色，漂洗，在紫外透射仪下观察结果。

PCR反应的反应体系和扩增程序分别为：

反应体系：PCR混合液25μL，其中10×PCR缓冲液2.5μL、25mM MgCl₂4μL、dNTPs1μL、引物rfbE-F和rfbE-R各1.5μL、引物Flic-F和Flic-R各1μL、待检样本3μL及去离子水9.5μL。

扩增程序：95℃5min；随后进行35个循环，每个循环包括95℃20s，60℃20s，72℃20s；最后72℃3min，于4℃停止反应。

大肠杆菌O157:H7双重PCR快速检测方法的试剂盒，该试剂盒含有以下试剂：

A液：PCR反应液，含10×PCR缓冲液、MgCl₂、dNTPs和上下游引物；

B液：含大肠杆菌O157:H7细菌DNA，作为阳性对照，；

C液：去离子水，作为阴性对照。

PCR反应液为每管25μL PCR反应体系中含10×PCR缓冲液2.5μL、25mM MgCl₂4μL、dNTPs 1μL、引物rfbE-F和rfbE-R各1.5μL、引物Flic-F和Flic-R各1μL，去离子水9.5μL。

该试剂盒含有PCR反应管。