[发明专利]一种大丽轮枝菌基因敲除的方法

权利要求书

1.一种大丽轮枝菌基因敲除的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：构建用于同源重组的重组质粒，该重组质粒由载体和同源重组DNA片段组成，所述同源重组DNA片段含有用于替代待敲除基因的外源抗性基因和位于该外源抗性基因两侧的满足同源重组要求的侧翼序列，所述载体含有外源条件致死基因；通过农杆菌介导的方法，将所述重组质粒转化至大丽轮枝菌中进行同源重组，得到转化子，并筛选出阳性转化子。

2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述外源条件致死基因为HSVtk基因，其含有如SEQ ID NO：1所示序列的DNA片段，所述筛选出阳性转化子的方法包括，向体系中加入与外源抗性基因相对应的抗生素和条件致死基因所对应的5’-氟脱氧尿苷，且5’-氟脱氧尿苷的浓度为40-60μM。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述载体的序列如SEQ IDNO：2所示，所述外源条件致死基因位于载体的T-DNA中。

4.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述外源抗性基因为潮霉素抗性基因。

5.根据权利要求1或2所述的方法，其中，位于该外源抗性基因两侧的满足同源重组要求的侧翼序列与待敲除基因两侧的侧翼序列相同，且所述侧翼序列的长度为1000-1500个核苷酸。

6.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述待敲除基因为大丽轮枝菌的ADE4基因和/或ChsV基因。

7.根据权利要求1或2所述的方法，其中，构建所述同源重组DNA片段的方法为融合PCR法，构建所述重组质粒的方法为Gateway克隆法。

8.根据权利要求7所述的方法，其中，构建所述重组质粒的方法包括在融合PCR步骤之前，通过常规PCR的方法分别获得待敲除基因上游侧翼序列的DNA片段、外源抗性基因序列的DNA片段和待敲除基因下游侧翼序列的DNA片段，优选地，用于获得待敲除基因上游侧翼序列的DNA片段的下游引物的核酸序列如SEQ ID NO：3所示，用于获得待敲除基因下游侧翼序列的DNA片段的上游引物的核酸序列如SEQ ID NO：4所示；在融合PCR步骤之后，以融合PCR得到的产物为模板，以5’端分别带有GatewayBP反应的接头的引物为引物，进行PCR，得到带有接头的同源重组DNA片段，用于下一步与载体的连接。

9.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述农杆菌介导的转化方法包括将重组质粒转化至农杆菌感受态细胞中，并将转化后的农杆菌感受态细胞与大丽轮枝菌共培养，其中，所述共培养在微孔滤膜上进行，且所述大丽轮枝菌的孢子浓度为4×10⁶-6×10⁶个/毫升。

10.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述方法还包括对筛选得到的阳性转化子的验证，所述验证通过PCR的方法进行，所述PCR的引物为与外源抗性基因两侧的侧翼序列配对的引物。