[发明专利]一种大丽轮枝菌基因敲除的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种大丽轮枝菌基因敲除的方法。

背景技术

我国是农业大国，作为仅次于粮食的第二大农作物的棉花是关系国计民生的战略物资，也是涉及农业和纺织工业两大产业的商品，是全国1亿多棉农收入的主要来源，是纺织工业的主要原料，也是广大人民的生活必需品，棉纱及棉布还是出口创汇的重要商品。因此，棉花的生产、流通、加工和消费，与人民群众的生活和广大棉农的利益息息相关，对国民经济的发展也有着重要影响。

由大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)引起的黄萎病是棉花的主要病害，严重影响棉花的生产，因此黄萎病的防治对于棉花生产的重要性不言而喻，其中，研究大丽轮枝菌中各个基因的功能，尤其是寻找致病相关基因是重要研究课题，而基因敲除技术是研究基因功能最有效的手段。

现有技术中大丽轮枝菌基因敲除的方法主要包括载体构建，农杆菌介导的转化和转化子筛选三个关键步骤，其中转化子筛选是一个难点，人们往往要筛选大量的转化子，以期得到需要的基因敲除的阳性转化子。这是因为将同源重组DNA片段克隆进T-DNA(transfer DNA)后，借助农杆菌介导的转化方法虽然极大地提高了同源重组片段的转化效率，但是由于T-DNA自身的性质，它会随机整合到该菌基因组的某一区段，造成了T-DNA的随机插入转化子和同源双交换产生的基因敲除的阳性转化子都带有同样的抗生素选择标签而难于区分，而同源重组的效率相对随机插入的效率要低很多，因此，基因敲除的转化子数量要远远少于随机插入的转化子，从而使得阳性转化子的筛选方法繁琐、费时，同时浪费大量的人力、物力和财力。因此，是一种效率低下的基因敲除体系。

发明内容

本发明的目的是克服上述现有技术中的缺陷，提供一种简便、高效的筛选阳性转化子的大丽轮枝菌基因敲除的方法。

本发明提供了一种大丽轮枝菌基因敲除的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：构建用于同源重组的重组质粒，该重组质粒由载体和同源重组DNA片段组成，所述同源重组DNA片段含有用于替代待敲除基因的外源抗性基因和位于该外源抗性基因两侧的满足同源重组要求的侧翼序列，所述载体含有外源条件致死基因；通过农杆菌介导的方法，将所述重组质粒转化至大丽轮枝菌中进行同源重组，得到转化子，并筛选出阳性转化子。

通过上述方法分别对大丽轮枝菌的ADE4基因和ChsV基因进行敲除，在随机挑选的15个ADE4基因敲除的候选转化子中有13个是阳性转化子，基因敲除转化子在总的转化子中所占比例高达87％；在随机挑选的16个ChsV基因敲除的候选转化子中有7个是阳性转化子，基因敲除转化子在总的转化子中所占比例为44％；而林春花(林春花、郑服丛，2008)使用传统的转化子筛选方法构建了稻瘟病MgORP1基因敲除突变株，基因敲除转化子在总的转化子中所占比例仅为1.8％。由此可见，本发明的方法相对现有技术的大丽轮枝菌的基因敲除方法的效率大大提高了。

附图说明

图1为构建用于同源重组的重组质粒的过程图；

图2为构建用于同源重组的重组质粒的各步骤反应的产物的琼脂糖凝胶电泳图；

图3显示了ADE4基因敲除的候选转化子的筛选结果；

图4显示了ChsV基因敲除的候选转化子的筛选结果。

具体实施方式

本发明提供了一种大丽轮枝菌基因敲除的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：构建用于同源重组的重组质粒，该重组质粒由载体和同源重组DNA片段组成，所述同源重组DNA片段含有用于替代待敲除基因的外源抗性基因和位于该外源抗性基因两侧的满足同源重组要求的侧翼序列，所述载体含有外源条件致死基因；通过农杆菌介导的方法，将所述重组质粒转化至大丽轮枝菌中进行同源重组，得到转化子，并筛选出阳性转化子。

术语“基因敲除”为将细胞基因组中某基因去除或使基因失去活性的技术。包括去除原核生物细胞、真核生物的生殖细胞、体细胞或干细胞基因组中的基因等。广义的基因敲除包括某个或某些基因的完全敲除、部分敲除、基因调控序列的敲除以及成段基因组序列的敲除。本发明中所述基因敲除指广义的基因敲除。