[发明专利]一种配对双末端文库构建方法及用该文库进行基因组测序的方法有效
| 申请号： | 201110049647.X | 申请日： | 2011-03-02 |
| 公开（公告）号： | CN102181943A | 公开（公告）日： | 2011-09-14 |
| 发明（设计）人： | 徐安龙;付永贵;周思思 | 申请（专利权）人： | 中山大学 |
| 主分类号： | C40B50/06 | 分类号： | C40B50/06;C40B40/08;C12N15/63;C12N15/10;C12Q1/68 |
| 代理公司： | 广州三环专利代理有限公司 44202 | 代理人： | 郝传鑫 |
| 地址： | 510275 广东*** | 国省代码： | 广东;44 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 一种 配对 末端 文库 构建 方法 进行 基因组 | ||
1.一种配对双末端文库构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
(a) 提取基因组文库中的质粒；
(b) 使步骤(a)中的质粒片段化至具有预期尺寸的片段；
(c) 利用甲基转移酶使步骤（b）得到的片段上特定的限制性内切酶位点甲基化；
(d) 补平步骤（c）得到的片段的末端，并在补平的片段两端连接接头，所述接头具有步骤（c）中所述的特定的限制性内切酶位点，用外切酶消化掉未连上接头的片段；
(e) 使用所述特定的限制性内切酶消化步骤（d）生成的片段，以产生粘性末端，随后环化，并用外切酶消化掉未环化的线性片段；
(f) 使用复合引物扩增环化后的产物，并对产物进行筛选，得到目的片段。
2. 如权利要求1所述的配对双末端文库构建方法，其特征在于，步骤(b)中的预期尺寸为比基因组文库所用载体大100-1500bp。
3. 如权利要求1所述的配对双末端文库构建方法，其特征在于，步骤（c）中被甲基化的特定的限制性内切酶位点为EcoR I。
4. 如权利要求1所述的配对双末端文库构建方法，其特征在于，步骤(d)中的所述接头为茎环结构。
5. 如权利要求4所述的配对双末端文库构建方法，其特征在于，步骤(e)中使用特定的限制性内切酶消化片段之后，还包括PCR纯化以及进行片段大小筛选的步骤，然后再对基因片段进行环化。
6. 如权利要求1所述的配对双末端文库构建方法，其特征在于， 步骤（f）中扩增所用的复合引物，该引物由两部分组成，包括5'端的测序引物以及3'端的与质粒载体末端互补的特异扩增引物。
7. 如权利要求1所述的配对双末端文库构建方法，其特征在于，步骤(f)中产物的筛选步骤包括先进行第一次PCR，之后用PCR纯化磁珠进行第一次片段大小筛选，再以第一次筛选后得到的片段为模板进行第二次PCR，随后用胶回收的方法进行第二次片段大小筛选，得到目的片段。
8.一种基因组文库配对双末端高通量测序方法，其特征在于，包括以下步骤：
(i)按权利要求1的方法构建所述基因组文库的配对双末端文库；以及
(ii)对配对双末端文库进行高通量测序。
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