[发明专利]一种配对双末端文库构建方法及用该文库进行基因组测序的方法

说明书

技术领域

发明涉及一种配对双末端文库构建方法及用该文库进行基因组测序的方法。

背景技术

基因文库的建立和使用是70年代早期重组DNA技术的一个发展。人们为了分离基因，特别是分离真核生物的基因，从1974年起相继建立了大肠杆菌、酵母菌、果蝇、鸡、兔、小鼠、人、大豆等生物以及一些生物的线粒体和叶绿体 DNA的基因文库。基因文库的建立使分子遗传学和遗传工程的研究进入了一个新时期。

一个生物体的基因组DNA用限制性内切酶部分酶切后，将酶切片段插入到载体DNA分子中，所有这些插入了基因组DNA片段的载体分子的集合体，将包含这个生物体的整个基因组，也就是构成了这个生物体的基因文库。将这些载体导入到受体细菌或细胞中，这样每个细胞就包含了一个基因组DNA片段与载体重组DNA分子，经过繁殖扩增，许多细胞一起包含了该生物全部基因组序列，我们将这一个集合体叫做基因文库。由于制备DNA片段的切点是随机的，所以每一克隆内所含的 DNA片段既可能是一个或几个基因，也可能是一个基因的一部分或除完整基因外还包含着两侧的邻近DNA顺序。

一个基因文库中应包含的克隆数目与该生物的基因组的大小和被克隆 DNA片段的长度有关。原核生物的基因组较小，需要的克隆数也较少；真核生物的基因组较大，克隆数需相应增加，才能包含所有的基因。此外，载体容纳外源DNA片段的大小即载体容量越大，则所需总克隆数越少；反之则所需数越多。如果一个基因文库的总克隆数较少，则从中筛选基因虽然比较容易，但给以后的分析造成困难，因为片段的长度增加了。如果要使每一克隆中的 DNA片段缩短，就须增加克隆数，所以在建立基因文库前应根据研究目的来确定 DNA片段的长度和克隆的数目。

随着大规模测序与生物信息学技术的发展和广泛应用，越来越多的物种的基因组数据被人们所利用，而对基因组数据拼接的精确性对人们认识并有效地利用这些信息起着至关重要的作用。制备配对双末端文库（Paired-end library）是一种增加数据拼接精确性的有效方法，通过应用Paired-end技术，可以对测序产生的邻接片段（contigs）进行排序，并决定它们的相对位置。现在不同的测序公司均有推出不同的Paired-end文库制备方法，如Roche，Illumina，并且得到广泛应用，但其Paired-end文库的跨度均在20kb以内, 主要因为现有的制备方法先要将提取到的基因组DNA用HydrogenShear打断到一定大小，片段长度越大，回收率越低，造成起始基因组量变大；同时片段长度越大，打断后均一性越差，对后期的基因组拼接会有影响；再者，在文库制备中间有一步骤需要对片段进行自身环化，片段越大，环化越难，成功率相对也降低。所以跨度更大的Paired-end文库制备方法现阶段还未建立，研究这一方面新的方法进行研究探索将对基因组数据的拼接有着重要意义。

发明内容

本发明提供一种利用已构建好的基因组DNA文库构建超长跨度的配对双末端文库的方法。

本发明的配对双末端文库构建方法，包括以下步骤：(a) 提取基因组文库中的质粒；(b) 使步骤(a)中的质粒片段化至具有预期尺寸的片段； (c) 利用甲基转移酶使步骤（b）得到的片段上特定的限制性内切酶位点甲基化；(d) 补平步骤（c）得到的片段的末端，并在补平的片段两端连接接头，所述接头具有步骤（c）中所述的特定的限制性内切酶位点，用外切酶消化掉未连上接头的片段；(e) 使用所述特定的限制性内切酶消化步骤（d）生成的片段，以产生粘性末端，随后环化，并用外切酶消化掉未环化的线性片段；以及(f) 使用复合引物进行扩增环化后的产物，并对产物进行筛选，得到目的片段。

本发明的配对双末端文库构建方法，优选地，步骤(b)中的预期尺寸为比基因组文库所用载体大100-1500bp的范围。

本发明的配对双末端文库构建方法，优选地，步骤（c）中被甲基化的特定的限制性内切酶位点为EcoR I。

本发明的配对双末端文库构建方法，优选地，步骤(d)中的所述接头为茎环结构。

优选地，步骤(e)中使用特定的限制性内切酶消化片段之后，还包括PCR纯化以及进行片段大小筛选的步骤，然后再对基因片段进行环化。优选地可以使用PCR纯化磁珠进行片段大小筛选。

优选地，本发明的配对双末端文库构建方法中，在步骤(e)的环化过程后还包括用外切酶消化步骤，以去掉未环化的基因片段。