[发明专利]用于多重核酸测序的标签及其使用方法

说明书

技术领域

本发明涉及核酸测序技术领域，特别是多重核酸测序技术领域。另外，本发明还涉及标签及其使用方法，以及利用标签技术构建测序文库的方法。本发明的方法特别适用于第二代测序技术，尤其是Illumina/Solexa测序技术。

背景技术

最早的测序文库建库方法只适合对单个文库样品进行测序，不能将多个文库样品混合测序。但是随着测序技术的发展，测序平台的测序通量已经远远超出了单个文库所需要的数据量。为了实现多个文库样品混合测序，避免测序资源浪费，产生了多重核酸测序(Multiplex sequencing)技术。多重测序的基本理念是：在每个文库接头序列和插入片段之间加入一段用于识别样品来源的标签序列(也称为Index序列)，在测序时，使用标签特异性引物，测出每个文库的标签序列，根据标签序列不同，区分不同的文库。

以illumina公司的Illumina/Solexa测序平台的一种样品文库制备方法为例(Preparing Samples for Multiplexed Paired-EndSequencing，Part#1005361Rev.B，illumina)，如图1所示，建库过程如下：

首先将基因组DNA按照Illumina/SolexaDNA样品制备方法打断成主带小于500bp的一系列DNA片段；然后将因打断形成的粘性末端修复成平末端；再通过3′端加碱基“A”，使得DNA片段能与3′端带有“T”碱基的并含有用于标记样品来源的标签序列的接头连接；连接产物用电泳法选择回收目的片段的分子量大小；然后使用PCR技术扩增两端带有接头的DNA片段并对最后的PCR产物进行纯化。如图2所示，在测序时，将目的片段和标签序列一并测出，通过标签序列就可以识别样品文库的来源。

常规多重核酸测序时，一般是利用同样长度的标签(Index)，混合不同文库同时进行测序，常常会因为标签中碱基的偏向性，造成检测插入片段时光强参数的波动，影响输出的数据质量，导致数据结果不可信，不能真实的反映样品的相关信息，同时也将导致实验结果重复性低。

发明内容

本发明基于目前illumina公司的Illumina/Solexa测序平台提供的文库制备方法，将一段不同长度的标签(核苷酸序列)，例如长度呈梯度变化的核苷酸序列(即梯度标签)嵌入接头(也称为adapter)中或PCR引物中，同时考虑PCR引物的扩增效率和数据产出的偏向性因素，筛选出合适的不同长度的标签及含该标签序列的接头或PCR引物，并将该接头用于混合样品测序，并在此基础上，利用在PCR引物中加入标签序列用于混合样品测序，增强了该发明的灵活性和实用性。

本发明将经过筛选的不同长度的标签用于构成标签文库的接头，其中所述接头包含所述标签，从而构成各自相对应的标签接头，用作标签文库的接头。

本发明还可以将经过筛选的不同长度的标签构成用于扩增目的序列的PCR引物，其中所述PCR引物包含所述标签，从而构成各自相对应的标签PCR引物。

标签设计首先需要考虑标签序列之间的序列差异程度和碱基识别率。在标签混合量少于6个样品的情况下，必须考虑到混合后的标签上的每个碱基位点的GT含量。因为Illumina/Solexa测序过程中，碱基G和T的激发荧光一样，碱基A和C的激发光是一样的，因此必须考虑碱基“GT”含量与碱基“AC”含量的“平衡”，最后考虑数据产出的准确性和可重复性。在设计标签的过程中，本发明充分考虑到以上几个因素，同时避免了标签序列之间出现3或3个以上连续的相同碱基的出现，这样可以降低序列在合成过程中或测序过程中的错误率。标签序列本身嵌入接头中，也要尽可能的避免出现发夹结构或与测序引物及其反向互补序列相同的现象。

在本发明的一个具体实施方式中，将不同长度的核苷酸序列(标签)包含在用于扩增目的序列的PCR引物中，从而构成各自相对应的标签PCR引物，首先将总DNA样品利用机械法或酶切法打断成一定长度的片段。片段与接头连接后，再通过标签PCR引物对目的片段进行扩增，最后通过琼脂糖电泳并切胶回收目的片段文库。

在本发明的一个具体实施方式中，将不同长度的核苷酸序列(标签)嵌入现有文库的接头(例如末端)中，形成标签接头(例如梯度标签接头)。首先将总DNA样品利用机械法或酶切法打断成一定长度的片段，并在片段末端形成随机的粘性末端，之后，与标签接头进行连接反应。目的片段与标签接头连接后，再通过特定的PCR引物对目的片段进行扩增，最后通过琼脂糖电泳并切胶回收目的片段文库。