[发明专利]一种改性葡聚糖转基因载体及其制备方法与应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种转基因载体及其制备方法，更具体地说，涉及一种改性葡聚糖转基因载体及其制备方法。

背景技术

基因治疗是指将人的正常基因或有治疗作用的基因通过一定方式导入人体靶细胞以纠正基因的缺陷或者发挥治疗作用。应用于基因治疗的载体主要有病毒载体(viral vector)和非病毒载体(nonviral vector)两种。病毒载体在基因治疗中取得了一些突破性进展，但是在临床应用过程中，其免疫原性和潜在致癌性等仍然是其难以克服的重大隐患。非病毒载体作为基因递送的另一条途径，被人们广泛研究，包括裸DNA、脂质体、阳离子高聚物等。

阳离子高聚物作为非病毒载体的一种，它既存在非病毒载体的特点(即低毒性，低免疫原性和低致癌性)，还有自身的优势——易于制备和携带目的基因能力高，这些更加有利于其作为转基因载体的应用。常见的阳离子高聚物能够通过强静电作用能够有效缩合DNA，形成的聚电解质复合物(PECs)较为稳定。这些PECs易于细胞内化，从内涵体中逃逸，并能保护DNA免受DNA酶的降解。因此，阳离子高聚物成为非病毒基因载体的重要组成部分，但是阳离子高聚物作为基因载体应用时，仍呈现出了一些问题，例如生物相容性差、有毒性、生物降解性低以及转染效率低等。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种生物相容性好、毒性小、稳定性高的阳离子高聚物作为非病毒型转基因载体进行使用。

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种制备上述阳离子高聚物的方法。

本发明的目的还在于提供一种上述阳离子高聚物的应用。

本发明的上述目的通过下述技术方案予以实现。

本发明的改性葡聚糖转基因载体，以葡聚糖分子为主链，取代基为氢原子或者NH₂(CH₂)n₁NH(CH₂)n₂NH₂，n₁为1-5，n₂为1-5，其分子式如下：

R＝H或NH₂(CH₂)n₁NH(CH₂)n₂NH₂

其中n₁优选1-3，更优选为3，n₂优选1-3，更优选为3。葡聚糖数均分子量优选为四万。

一种制备改性葡聚糖转基因载体的方法，按照下述步骤进行：利用三氟乙酸乙酯对小分子修饰剂的伯胺进行保护，然后将葡聚糖、伯胺受到保护的小分子修饰剂和N，N’-羰基二咪唑混合均匀反应，使小分子修饰剂通过仲胺连接到葡聚糖的羟基上，最后对受到保护的伯胺进行脱保护，最终使葡聚糖分子与小分子修饰剂键接，即得到改性葡聚糖转基因载体。

在上述制备方法中，所述小分子修饰剂是既有伯胺又有仲胺的小分子，分子式为NH₂(CH₂)n₁NH(CH₂)n₂NH₂，其中n₁为1-5，n₂为1-5。n₁优选1-3，更优选为3，n₂优选1-3，更优选为3，如二氨基二丙基胺。

在上述制备方法中，利用三氟乙酸乙酯对小分子修饰剂的伯胺进行保护时，一般在80～90℃下进行回流反应至少24小时，以保证伯胺的保护效果；此外，反应体系使用的溶剂为极性溶剂，如水、乙腈。

在上述制备方法中，将葡聚糖、小分子修饰剂和N，N’-羰基二咪唑混合均匀反应时，一般在60～90℃下反应至少24小时，葡聚糖的用量大于小分子修饰剂，以保证小分子修饰剂能够键接到葡聚糖分子上；同时为保证反应的效率，小分子修饰剂与N，N’-羰基二咪唑的摩尔比是1∶1或者小分子修饰剂稍过量；可以选择在反应结束后，采用透析方式进行提纯；此外，反应体系使用的溶剂可为极性溶剂，如二甲基亚砜(DMSO)或二甲基甲酰胺(DMF)。

在上述制备方法中，采用溶液体积为25％的氨水在温度为60℃下对氨基进行脱保护，然后将产物在70-80℃下悬蒸，并且在去离子水中透析，冻干，即得到改性葡聚糖转基因载体。