[发明专利]一种小鼠白内障模型及其构建方法

说明书

技术领域

本发明属生物技术和医学领域，具体涉及小鼠白内障自发突变基因纯系BALB/cAnSlac-Crygc-del的构建及其应用。

背景技术

小鼠已成为研究人类疾病的一种重要模式生物，哺乳动物发育相关的功能基因的鉴定多来源于自发或诱发突变的小鼠。小鼠先天性白内障(congenital cataract)为出生时或出生后第一年内发生的晶状体混浊，小鼠白内障表型多由单基因突变引起，且具有高度的遗传异质性，与晶状体发育和分化有关的基因突变可形成遗传性白内障。

2006年在，在BALB/cAnSlac近交系小鼠与ICR远交系的杂交F1代群体中，发现2只自发突变导致白内障的小鼠(上述两品系杂交自发突变导致白内障小鼠的几率为千分之0.625)。经与BALB/cAnSlac进一步回交10代，繁育携带白内障症状的纯系小鼠，保持了稳定的显性常染色体遗传特征，但未知其具体突变基因及位置。

目前对单基因遗传致病基因的克隆多采用位置克隆的策略。通过覆盖高密度的遗传位标(marker)在家系中进行基因组扫描，基因组扫描的关键是计算所需遗传位标的个数。一般认为72只F2代患病白内障小鼠仅需要46个STR(short tandem repeat)位点用于基因定位。对于显性遗传性白内障小鼠，若某位点纯合基因型占患病样本的比率低于25％，即为连锁，通过连锁分析的方法，先找到与致病基因紧密连锁的标记，从而将致病基因初步定位于染色体某一适当狭窄的区域，然后在该区域内使用覆盖程度更高的标记物作深入的连锁分析，就可将致病基因确定在较小的区域。cDNA测序技术结合基因分型技术进一步验证了白内障基因的突变位点和方式，由此构建的小鼠白内障自发突变基因纯系，给予了我们从遗传学角度研究个体疾病发生机制的良好平台。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种携带白内障症状的纯系小鼠BALB/c+/+的模型及其构建方法，本发明的白内障症状纯系小鼠BALB/c+/+可以研究在与C3H/He连续回交2代基础上，挑选白内障症状小鼠用于遗传学鉴定白内障基因，得到了稳定遗传的小鼠白内障自发突变基因纯系BALB/cAnSlac-Crygc-del，是用遗传学方法研究自发性白内障致病机制的有力工具。

本发明的小鼠白内障模型构建方法，包括：

(1)回交

(a)取BALB/cAnSlac小鼠与SLAC:ICR小鼠杂交，获得子代，筛选出白内障小鼠；

(b)以白内障小鼠为父本，以BALB/cAnSlac品系为母本杂交得到F1代；F1代挑选白内障症状小鼠与BALB/cAnSlac回交至少10代，培育成携带白内障症状的纯系小鼠BALB/c+/+；

(c)BALB/c+/+小鼠与遗传背景已知的C3H/He连续回交2代，获得F2代，挑选白内障症状小鼠用于遗传学鉴定。

(2)遗传学鉴定

(a)从NCBI(National Center for Biotechnology Information)选取平均覆盖19条常染色体的共44个STR位点，STR位点在C3H/HeJSlac和BALB/cAnSlac两个品系中的片断长度互不相同，并相差4个bp以上，对这些位点进行引物设计，鉴定回交小鼠的基因组DNA。

(b)从NCBI(National Center for Biotechnology Information)上进一步选取精细定位所用遗传位标，STR位点在C3H/HeJSlac和BALB/cAnSlac两个品系中的片断长度互不相同，并相差4个bp以上，然后对这些STR位点进行引物设计，通过全基因组扫描与单倍型分析，将白内障相关基因精细定位到小的区段内；

(c)挑选区段内晶状体蛋白基因Cryg作为候选基因，针对其cDNA序列设计合适的引物，以野生型、白内障杂合型、纯合型为模板，进行PCR扩增，将PCR产物测序；

(d)对Cryg突变位点设计一对荧光引物，以野生型、白内障杂合型、纯合型为模板，进行扩增，验证Cryg突变位点，其中：

上游引物5’→3’CAGAATGCGGCTGTATGAGA

下游引物5’→3’GAGCCCGCCTTAGCATCTAC。

(e)BALB/cAnSlac-Crygc-del纯系的突变基因为Crygc亚基第三个外显子1个碱基缺失突变。