[发明专利]一种可以诱导肿瘤免疫反应的海藻酸盐微颗粒的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种海藻酸盐微颗粒，尤其涉及一种可以诱导肿瘤免疫反应的海藻酸盐微颗粒的制备方法。

背景技术

恶性肿瘤治疗仍然是世界难题，免疫生物治疗是当前研究热点。树突状细胞(dendritic cells，DC)是目前所知的功能最强，并且是唯一能激活初始T细胞(native T cell)的专职抗原递呈细胞(antigen presenting cell，APC)，具有强大的激活CD8⁺T细胞毒淋巴细胞(CTL)及CD4⁺T辅助细胞的能力，控制着体内免疫反应的过程，是肿瘤免疫反应的中心环节。DC主要分布于骨髓、外周血及抗原暴露较多的器官和淋巴组织中，在未接触处理抗原之前的DC称为未成熟DC(immature DC)，不成熟的DC具有极强的捕获和加工处理抗原的能力；当DC捕获处理抗原后则转化为成熟DC(mature DC)，在这个过程中，成熟的DC迁移进入淋巴组织，并具有非常强的激活初始(naive)T细胞，诱导特异性免疫应答的能力。

当前用DC细胞加肿瘤抗原或多肽在体外培养、用肿瘤细胞总RNA转化修饰DC等方法制备的DC疫苗已经在临床应用。但是，由于外周血有核细胞中的DC比例仅占总细胞的0.1％，并且肿瘤细胞本身往往分泌一些细胞因子(如IL-10、VEGF、IL-6、TGF-β等)进而抑制DC的分化、募集和递呈抗原的能力。因此，当前制备DC疫苗必须在体外培养扩增，然后再把病人的肿瘤细胞或人工制备的抗原和扩增的DC细胞共同进行培养，让DC在体外对肿瘤抗原进行适当处理后再输回患者体内。这种制备疫苗的方法过程比较复杂，需要一定的技术和经验，制备方法较难标准化，治疗成本也高，疗效也往往随着实验室不同而不同。这种“作坊”式的制备方法严重影响了DC疫苗在临床的进一步应用。由此可见，寻找一种诱导肿瘤免疫的“体内”DC疫苗方法能够使DC疫苗治疗肿瘤变得简单有效，是一种更好的治疗策略。

研究表明，巨噬细胞炎症蛋白-3α(macrophage inflammatory protein-3α，MIP-3α)是DC特异的趋化因子，它通过吸引表达CCR6的未成熟DC趋化于病原感染组织，使DC能够接触处理和递呈抗原，此后，DC表达CCR6下调，迁移进入淋巴组织，进一步转化为成熟的DC并将抗原递呈给CD8+T淋巴细胞，进而诱导获得性免疫的产生。为此，我们设想，如果设法在体内让肿瘤细胞直接表达分泌MIP-3α，就能促使DC向肿瘤细胞趋化，进而增加DC细胞和肿瘤细胞抗原接触的机会，提高DC递呈肿瘤抗原的能力，这样就可达到当前体外DC疫苗的治疗目标，但是却省去复杂的体外操作，降低治疗成本，较体外DC疫苗安全，具有更好的临床应用前景。

海藻酸盐(alginate)是从海藻中提取的一种有机化合物，在体外溶解于水后再与钙离子接触便会形成固体状结构。我们的研究结果表明，包被肿瘤细胞的海藻酸盐颗粒植入体内后肿瘤细胞能够存活2周以上，并且细胞分泌的抗血管生成因子(如endoglin，TGF-β等)能够自由进出。目前，研究结果也表明，直径为200～400μm的海藻酸盐微粒包被的细胞可在异种动物体内存活，并且能让低分子量营养物质(如电解质，氧、细胞代谢产物、细胞因子等生物活性物质)自由进出，但是其它大分子物质(如免疫球蛋白等)则被排斥于海藻酸盐颗粒之外，这样就能使异种或同种细胞的存活，并且可以分泌细胞活性物质。

综上所述，我们设想利用基因工程技术将MIP-3α质粒转化肿瘤细胞，然后将转染MIP-3α的肿瘤细胞包裹于海藻酸盐微颗粒中，并且在制作海藻酸盐微颗粒的过程中，加进细菌成分(细菌抗原是天然的诱发免疫反应的物质)。我们将包含有可以分泌MIP-3α的肿瘤细胞、细菌成分的藻酸微颗粒当作疫苗、注射于肿瘤组织、皮下或腹腔，就有可能诱导DC细胞及其它免疫反应细胞到达海藻酸盐微颗粒部分，在处理细菌和海藻酸盐微颗粒的同时，也将肿瘤细胞抗原进行处理，因而诱导强有力的肿瘤免疫反应，这是一种具有治疗肿瘤前景的新的技术方法。

发明内容

本发明的目的在于：提供一种可以诱导肿瘤免疫反应的海藻酸盐微颗粒的制备方法，将本发明的MIP-3α肿瘤细胞细菌海藻酸盐微颗粒注入小鼠膜腔，在肿瘤模型中证实可以有效抑制肿瘤生长和转移，具有明显的治疗肿瘤的作用，展示出了良好的应用前景。

为实现上述目的，本发明的技术方案为：提供一种可以诱导肿瘤免疫反应的海藻酸盐微颗粒的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：

(1)、构建MIP-3α真核表达质粒并将其转染肿瘤细胞；