[发明专利]大孔载体“同步法”共价交联-固载木瓜蛋白酶聚体及方法

权利要求书

1.一种使用大孔材料为载体“同步法”共价交联-固载木瓜蛋白酶聚体的方法，其特征是步骤如下：

(1)载体表面氨基改性

所选载体为表面具有羟基基团的无机或有机材料，将载体洗净，于90～120℃烘干至质量不再改变；将10～30mL硅烷偶联剂与无水乙醇以1∶1～1∶3比例均匀混合5～30min，然后加入2～10g载体材料，令载体质量与硅烷偶联剂体积比为1∶3～1∶5(g∶mL)，于50～70℃水浴中减压旋蒸至液体不再减少；用乙醇洗涤载体3～4次，放于90～120℃烘箱中干燥过夜至质量不再改变，载体表面氨基含量达到5～15μmol/g；

(2)木瓜蛋白酶的吸附

用pH为4～10的磷酸缓冲液溶解木瓜蛋白酶，配成浓度为0.05～0.25g/mL的木瓜蛋白酶溶液；取1～5mL此酶溶液，加入氨基改性后的大孔载体颗粒1～5g，于4～25℃下振摇吸附2～6h；

(3)木瓜蛋白酶沉淀

吸附结束后，用磷酸缓冲液洗涤载体颗粒一次；随后将吸附有木瓜蛋白酶的载体颗粒1～5g加入到1～10mL沉淀剂中，继续振摇10～30min；

(4)“同步法”共价交联

向步骤(3)中所得的沉淀体系中加入交联剂至最终浓度为1～5％；混合均匀，于4～25℃下交联2～24h，使沉淀酶聚体在生成CLEAs的同时也与载体孔道表面氨基共价交联，最终实现大孔载体“同步法”共价交联-固载CLEAs；所得固定化酶用蒸馏水洗涤3～4次，冻干即得大孔载体固载化CLEAs颗粒。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述大孔载体为硅胶、三氧化二铝或纤维素。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的硅烷偶联剂为γ-氨丙基三乙氧基硅烷、N-(β-氨乙基)-γ-氨丙基三甲氧基硅烷或N-β-(氨乙基)-γ-氨丙基甲基二甲氧基硅烷。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的沉淀剂为乙醇、甲醇、丙酮、正丙醇、异丙醇、叔丁醇、乙腈、饱和硫酸铵或聚乙二醇。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的交联剂为戊二醛、碳化二亚胺、羟甲基磷化氢或琥珀酰亚胺。

6.权利要求1～5的所制备的木瓜蛋白酶聚体，其特征是木瓜蛋白酶聚体是在孔径大于0.5μm的载体的孔道中填埋有木瓜蛋白酶。