[发明专利]大孔载体“同步法”共价交联-固载木瓜蛋白酶聚体及方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种新型固定化酶生物催化剂的制备方法，特别是一种使用大孔材料为载体“同步法”共价交联-固载木瓜蛋白酶聚体及方法，属于酶的固定化技术领域。

背景技术

交联酶聚体(cross-linked enzyme aggregates，CLEAs)是一种新型的固定化酶方法，在制备过程中首先利用沉淀剂使溶解态的酶聚集沉淀，随后对酶沉淀聚体进行共价交联。该方法制得的固定化酶具有较宽的最适催化pH范围和较宽的最适催化温度范围，对高温、有机溶剂、强酸强碱等具有较高的稳定性，是一种高效、稳定的固定化酶方法。然而，CLEAs的机械强度相对较低，粒径较小(通常为微米级)，采用普通的过滤方法难以回收，限制了其在工业上的利用。因此，利用载体固定CLEAs以提高CLEAs机械稳定性和操作回用性的方法近几年来备受关注。2007年Kim等人自制了一种内孔径37nm，通道直径13nm的分子筛载体HMMS(Hierarchically-ordered Mesocellular Mesoporous Silica)，并采用先吸附后交联两步的方法令酶物理填埋在37nm的内孔形成CLEAs，而不会从13nm的孔道泄露出来，形成类似“瓶中船”式结构(Biotechnol.Bioeng.2007，96：210-218)；郭军等也公开了一种通过先沉淀后交联两步将CLEAs物理填埋于孔径为10～300nm，最适孔径为30nm的多孔微球载体上的方法(中国发明专利，申请号：200810056594)。李红公开了一种以壳聚糖为原料制备壳聚糖微球，将壳聚糖微球加入木瓜蛋白酶溶液中，再经吸附-交联得到壳聚糖微球固定的木瓜蛋白酶(申请号：00117351.0)，此方法中所选用的壳聚糖载体在酸性溶液中不稳定，容易造成木瓜蛋白酶从载体上脱落。

通常的载体固定化酶方法由于载体多为纳米孔径材料，载酶量往往较低(10～30mg/g)，底物与产物的传质也受到一定限制；同时，以非共价方法固定于载体中的酶易于从载体内泄漏造成酶活损失，不利于工业上的重复回收利用。

发明内容

本发明的目的是提供一种“同步法”共价交联-固载木瓜蛋白酶聚体(或称固载化木瓜蛋白酶CLEAs)的制备方法，即利用孔径大于0.5μm的大孔载体，以化学共价法固定木瓜蛋白酶的交联酶聚体，而非物理填埋，从而改善CLEAs操作粒径，增加固定化酶载酶量，提高木瓜蛋白酶的稳定性的方法。为防止孔径增大造成的酶泄漏，采用“同步法”交联，即在制得CLEAs的同时将其以共价键的形式结合在载体孔道表面。

本发明提供的是一种以大孔材料为酶的固定化载体，经载体表面氨基改性、酶吸附、木瓜蛋白酶沉淀、同步交联共四步将木瓜蛋白酶以交联酶聚体的形式共价固定于载体上的方法。制备过程中CLEAs的形成和与载体的共价结合在同步完成，如图1所示。

本发明系一种固定化酶生物催化剂的制备方法的具有以下的制备过程和步骤：

(1)载体表面氨基改性

所选载体为表面具有羟基基团的无机或有机材料，将载体洗净，于90～120℃烘干至质量不再改变；将10～30mL硅烷偶联剂与无水乙醇以1∶1～1∶3比例均匀混合5～30min，然后加入2～10g载体材料，令载体质量与硅烷偶联剂体积比为1∶3～1∶5(g∶mL)，于50～70℃水浴中减压旋蒸至液体不再减少；用乙醇洗涤载体3～4次，放于90～120℃烘箱中干燥过夜至质量不再改变，载体表面氨基含量达到5～15μmol/g；

(2)木瓜蛋白酶的吸附

用pH为4～10的磷酸缓冲液溶解木瓜蛋白酶，配成浓度为0.05～0.25g/mL的木瓜蛋白酶溶液；取1～5mL此酶溶液，加入氨基改性后的大孔载体颗粒1～5g，于4～25℃下振摇吸附2～6h；

(3)木瓜蛋白酶沉淀

吸附结束后，用磷酸缓冲液洗涤载体颗粒一次；随后将吸附有木瓜蛋白酶的载体颗粒1～5g加入到1～10mL沉淀剂中，继续振摇10～30min；

(4)“同步法”共价交联

向步骤(3)中所得的沉淀体系中加入交联剂至最终浓度为1～5％；混合均匀，于4～25℃下交联2～24h，使沉淀酶聚体在生成CLEAs的同时也与载体孔道表面氨基共价交联，最终实现大孔载体“同步法”共价交联-固载CLEAs；所得固定化酶用蒸馏水洗涤3～4次，冻干即得大孔载体固载化CLEAs颗粒。

本发明所制备的木瓜蛋白酶聚体，是木瓜蛋白酶聚体是在孔径大于0.5μm的载体的孔道中填埋有木瓜蛋白酶。

具体说明如下：

载体表面氨基改性