[发明专利]一种奶牛宫颈粘液中抗精子抗体的检测方法

说明书

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种奶牛宫颈粘液中抗精子抗体的检测方法。

背景技术

抗精子抗体(antisperm antibody，AsAb)能与精子结合产生免疫反应而影响生殖能力。精子对雄性具有抗原性，而精子对雌性而言是同种异体免疫抗原，每一次交配都相当于一次免疫接种。生殖道局部和血清抗精子抗体是机体对精子抗原产生自身或同种异体免疫反应的产物，是引起免疫性不孕的主要原因。奶牛生产环节的核心是繁殖，防治不孕是要解决的首要问题。抗精子抗体对不育的影响，在奶牛的群体当中普遍存在，而相当一部分抗精子免疫不孕牛可以通过适当的针对性技术措施加以防治。奶牛免疫不孕可能并没有明显的征兆，周期正常、卵泡发育与排卵均正常，与明显的其他不孕类型相比更加隐蔽，对生产影响更为严重。早发现并采取必要防治措施非常重要。

抗精子抗体的检测方法还有间接免疫珠试验、间接混合抗球蛋白反应试验、精子制动试验、酶联免疫吸附试验和免疫胶体金渗滤斑点试验，等。

间接免疫珠试验(I-BT)和间接混合抗球蛋白反应试验(I-MAR)：试验方法和原理与IBT和MAR相同。唯一区别在于使用正常供体新鲜精液代替不育症患者精液，以去精浆供体精子与待测体液标本共同培养，使供体精子与标本中可能存在的AsAb结合，检测是否通过培养使供体精子获得了结合免疫珠的能力，或与MAR标记颗粒发生混合凝集的能力，判断标本中AsAb的存在。I-IBT也是WHO推荐用于体液AsAb检测的方法。与I-MAR相比，其优点是可以检测IgA类AsAb。还可以识别AsAb在精子表面的定位。

精子制动试验(SIT)：设计原理为抗体依赖的补体介导的细胞毒反应，主要用于体液标本中精子制动抗体的检测。将补体加热灭活后的患者血清和供者健康精子混合后，加入外源补体，若患者体液中含精子制动抗体，则出现精子运动力降低或死亡。由于只有IgG类型的AsAb才能被补体固定，而对于体液中占多数的IgA类AsAb则不能被检测；另外，有些结合于精子头部、而不引起精子制动作用的IgG类AsAb，也不能被检测；同时，本试验检测主观性较强，检测程序的数字化有助于避免主观判断的误差。

酶联免疫吸附试验(ELISA)：常用的方法为使用全精子或精子提取物包被多孔塑料板，由于全精子包被过程所导致的一些精子特异性抗原的变性和精子非特异性内部抗原的暴露，以及精子膜提取物包被可能缺失一些生育相关的关键抗原，其检测特异性不高。同时，由于这类方法几乎一概存在高背景噪音，实际灵敏度也不高。使用纯化精子特异性抗原作为ELISA的包被抗原，有望克服以上的缺点，从而使ELISA法最终成为一种真正实用的特异性AsAb检测方法。

免疫胶体金渗滤斑点试验(DIGFA)：以红色胶体金代替酶作为标记物进行斑点免疫结合试验(DIBA)。其测定原理是利用微孔膜的可滤性，在其反应膜上固定有精子抗原提取物，膜下装有吸水垫料，依次加入待测血清和胶体金标记的葡萄球菌A蛋白(SPA)，若血清中含有AsAb，即可在膜上显色。该法敏感、快速、简便，是目前国内临床上较为常用的AsAb检测方法，并有成品试剂盒出售。但同样不能定量，也不能排除生育无关AsAb引起的假阳性结果。

发明内容

针对上述现有技术中存在的问题与不足，本发明的目的在于提供一种检测奶牛抗精子抗体的方法，该检测方法能够简易、快速检出奶牛群抗精子免疫不孕牛的方法。

实现上述发明目的技术方案是：一种奶牛宫颈粘液中抗精子抗体的检测方法，包括下列步骤：

1)取奶牛发情盛期的宫颈粘液在-20℃进行冷冻备用；

2)取0.25ml活率≥0.40、密度≥10⁸精子/ml的公牛细管冻精，38℃水浴解冻，700g离心8min后弃上清液，加入EBSS 1ml悬浮，将悬浮液铺在预先放有2ml含10％胎牛血清的EBSS的试管底部，倾斜45°在37℃、5％CO₂培养箱中孵育45min，取上层清液；

3)将500μl浓度为60μg/ml～160μg/ml的菠萝蛋白酶液加入500μl室温下化冻宫颈粘液中，37℃温育30min，2600g离心15min；