[发明专利]一种检测结核分枝杆菌北京基因型的方法

说明书

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种检测结核分枝杆菌北京基因型的方法。

背景技术

北京基因型菌株是一类具有相似遗传背景的结核分枝杆菌。这类菌株的分布广泛，在世界各地都有发现，是传播更迅速、致病性更强、以及耐药形成更容易的一类菌株。目前对于北京基因型的定义是指菌株在间隔区寡核苷酸分型(Spoligotyping)指纹图谱上表现为35—43的间隔区中至少有三个杂交条带，而1—34的间隔区上有缺失的特异指纹图谱。

检测北京基因型的方法主要是采用间隔区寡核苷酸分型法特异性扩增结核分枝杆菌基因组中的间隔序列，根据上文提到的定义来判断序列之间的间隔序列数目，达到分型的目的。该方法是鉴定北京基因型的“金标准”。但在处理大样本时仍然是费时费力的，并且对于IS6110序列缺失的菌株无法进行准确分型。综合迄今为止的各种分型方法，或者对样本质量要求非常高，或者操作较为繁琐，实验需要昂贵的仪器，或者结果分析繁重、费用昂贵。因而一种全新，简便，快速的检测方法必然有着良好的应用前景。

发明内容

为了克服传统北京基因型检测方法耗时、复杂和昂贵的局限性，本发明提供一种以PCR技术为基础的简单、快速检测结核分枝杆菌北京基因型菌株的方法。

本发明提供的检测结核分枝杆菌北京基因型菌株的方法，是同时检测Rv2629（191位）A→C和Rv0444c（242位）G→C突变作为结核杆菌北京基因型分型的标志。具体而言，在结核分枝杆菌Rv2629和Rv0444c的基因片段中， 根据Rv2629（191位）A→C和Rv0444c（242位）G→C同时发生单核苷酸突变，则判定待检菌株为北京基因型菌株。

所述判定单核苷酸突变的方法为：设计特异性引物，通过PCR技术扩增Rv2629基因468bp片段，通过测序和序列比对可判定其191位核苷酸是否发生A→C突变；

同理，设计特异性引物，通过PCR技术扩增Rv0444c基因346bp片段，通过测序和序列比对可判定其242位核苷酸是否发生G→C突变；

首先对结核杆菌基因组进行抽提，根据结核分枝杆菌全基因组Rv2629、Rv0444c基因的序列，设计测序引物，扩增基因片段。

对于Rv2629基因，扩增片段为：SEQ.ID.NO.1; 为468bp ；

设计的测序引物为：

SeUP PRIMER （63-81）     5'  CGACGACTCGCACGACACT  3'

(记为SEQ.ID.NO.3)

SeDOWN PRIMER （509-530） 5'  CAGTTCATTCGGATGGCTTCTT  3'

(记为SEQ.ID.NO.4)；

对于Rv0444c基因，扩增片段为：SEQ.ID.NO.2；为346bp ；

设计的测序引物为：

SeUP PRIMER   （133-151）     5'  AACGACGAAGTTCGAGCCG  3'

(记为SEQ.ID.NO.5)

SeDOWN PRIMER（457-479）      5'  ACATTGTTCATCACCAGCAGACC  3'

(记为SEQ.ID.NO.6)；

扩增产物纯化后，自动序列分析仪进行序列分析。

如果同时检测到Rv2629（191位）A→C和Rv0444c（242位）G→C突变，则确定该结核杆菌分枝为北京基因型分型。

本方法中，通过PCR和基因测序鉴定了Rv2629基因的191位核苷酸发生A→C突变，导致67位密码子由GAT→GCT，其编码的氨基酸产生Asp→Ala变异；同时鉴定了Rv0444c基因的242位核苷酸发生G→C突变，导致81位密码子由GAG→GAC，其编码的氨基酸产生Glu→Asp变异。这两种突变仅同时发生于结核分枝杆菌北京基因型菌株中，而未见于H37Rv标准实验菌株和非北京型菌株中。

本发明所提供的两个基因在结核分枝杆菌中有很好的稳定性，通过基因扩增和序列比对分析检测单核苷酸突变，不仅操作简便、费用低廉，而且检测时间短、灵敏度高，在普通临床实验室就可完成，适于在临床或者科学研究中对结核杆菌菌株北京基因型的快速分型鉴定。