[发明专利]一种抗副溶血弧菌耐热溶血毒素单克隆抗体及其制备方法有效
| 申请号： | 201110056576.6 | 申请日： | 2011-03-09 |
| 公开（公告）号： | CN102676459A | 公开（公告）日： | 2012-09-19 |
| 发明（设计）人： | 杨靖亚;徐莉;张建;赵勇;陆晓帆;晁若瑜 | 申请（专利权）人： | 上海海洋大学;中国人民解放军防化指挥工程学院 |
| 主分类号： | C12N5/20 | 分类号： | C12N5/20;C07K16/12;C12R1/91 |
| 代理公司： | 上海天翔知识产权代理有限公司 31224 | 代理人： | 吕伴 |
| 地址： | 201306 上海市*** | 国省代码： | 上海;31 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 一种 溶血 弧菌 耐热 毒素 单克隆抗体 及其 制备 方法 | ||
1.一种杂交瘤细胞系，其特征在于，该杂交瘤细胞系已于2011年01月13日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.4542，该杂交瘤细胞系的名称为T6D4，通过源于被纯化的副溶血弧菌耐热溶血毒素——TDH免疫过的Ba1B/c小鼠的B淋巴细胞和小鼠骨髓瘤细胞SP2/0融合而成。
2.一种鼠抗副溶血弧菌耐热溶血毒素的单克隆抗体，其特征在于，由权利要求1所述杂交瘤细胞系分泌而得，该单克隆抗体为一种能与副溶血弧菌耐热溶血毒素发生免疫反应的单克隆抗体，其制备过程如下：
(1)免疫抗原TDH的制备
利用多次层析方法，对以葡萄糖、Na2HPO3及胰蛋白胨和NaCl为主要组分的细菌培养液中的TDH进行提取与纯化，得到所述的免疫抗原TDH；
(2)免疫小鼠的脾细胞的制备
选择6～8周龄雌性小鼠(Ba1B/c小鼠)利用步骤(1)得到的免疫抗原TDH进行免疫，分离得到免疫小鼠的脾细胞；
(3)细胞融合与培养
培养小鼠骨髓瘤细胞SP2/0，与步骤(2)免疫小鼠的脾细胞进行混合，在聚乙二醇介导下进行细胞融合，在含有HAT的15％FCS选择培养基中进行37℃，5％CO2培养，分离培养细胞上清液；
(4)杂交瘤细胞的筛选与克隆化
用间接ELISA方法对步骤(3)的培养细胞上清液筛选阳性杂交瘤细胞，用有限稀释法进行克隆化，得到杂交瘤细胞系；
(5)杂交瘤腹水的制备
将第(4)步克隆的阳性杂交瘤细胞系注入灭菌石蜡处理过的小鼠腹腔，获得小鼠腹水；
(6)单克隆抗体的纯化
对步骤(5)得到的小鼠腹水，去上清，并用辛酸-饱和硫酸铵法进行纯化，得到抗副溶血弧菌耐热溶血毒素单克隆抗体。
3.如权利要求2所述的鼠抗副溶血弧菌耐热溶血毒素的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体蛋白亚型为IgG2a。
4.一种鼠抗副溶血弧菌耐热溶血毒素的单克隆抗体的制备方法，其特征在于，具体包括如下步骤：
(1)免疫抗原TDH的制备
利用多次层析方法，对以葡萄糖、Na2HPO3及胰蛋白胨和NaCl为主要组分的细菌培养液中的TDH进行提取与纯化，得到所述的免疫抗原TDH；
(2)免疫小鼠的脾细胞的制备
选择6～8周龄雌性小鼠(Ba1B/c小鼠)利用步骤(1)得到的免疫抗原TDH进行免疫，分离得到免疫小鼠的脾细胞；
(3)细胞融合与培养
培养小鼠骨髓瘤细胞SP2/0，与步骤(2)免疫小鼠的脾细胞进行混合，在聚乙二醇介导下进行细胞融合，在含有HAT的15％FCS选择培养基中进行37℃，5％CO2培养，分离培养细胞上清液；
(4)杂交瘤细胞的筛选与克隆化
用间接ELISA方法对步骤(3)的培养细胞上清液筛选阳性杂交瘤细胞，用有限稀释法进行克隆化，得到杂交瘤细胞系；
(5)杂交瘤腹水的制备
将第(4)步克隆的阳性杂交瘤细胞系注入灭菌石蜡处理过的小鼠腹腔，获得小鼠腹水；
(6)单克隆抗体的纯化
对步骤(5)得到的小鼠腹水，去上清，并用辛酸-饱和硫酸铵法进行纯化，得到抗副溶血弧菌耐热溶血毒素单克隆抗体。
5.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述单克隆抗体蛋白亚型为IgG2a。
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