[发明专利]一种抗副溶血弧菌耐热溶血毒素单克隆抗体及其制备方法

说明书

技术领域

本发明属于细菌监测和免疫学分析技术领域，具体涉及一种鼠来源杂交瘤细胞系和由该细胞系分泌的抗副溶血弧菌耐热溶血毒素单克隆抗体及其制备方法。 

背景技术

耐热溶血毒素(thermostable direct hemolysin，TDH)是副溶血弧菌(vibro parahaemolyticus，VP)产生的一种溶血毒素。是VP分泌的通行二聚体蛋白，不含糖或者脂质。TDH分子质量约46000，TDH为孔形成型毒素，对多种培养细胞与细胞毒性作用，具有潜在的心脏毒性作用，研究最多的是其溶血作用。TDH能使人、小白鼠、兔等红细胞(redblood cell，RBC)溶血，但对马和羊的RBC不发生溶血。 

副溶血弧菌是一种嗜盐性细菌，书弧菌科、弧菌属。存在于近海岸的海水和鱼类、贝类中，是一种重要的食源性致病菌，食用虾、蟹、贝类等水产品所致副溶血弧菌食物中毒，起病急骤，常有腹痛、腹泻、呕吐、失水、畏寒及发热。腹痛多呈陈发性绞痛，常位于上腹部脐周或者盲部。腹泻每日3～20余次不等，大便性状多样，多数为黄水样或黄糊便。越2％～16％呈典型的血水或者洗肉水样便，部分病人的粪便可以为脓血样或者粘液血样。由于吐泻，患者常与是谁现象，重度失水者可伴声哑和肌痉挛，个别病人血压下降面色苍白或者发绀以至意识不清。近年来副溶血弧菌引起食物中毒的发生规模以及人群暴露规模呈明显上升趋势，已成为我国首要的食源性致病菌。对该菌致病机制的初步研究发现其致病力主要有侵袭力溶血毒素和尿素酶。流行病学调查表明其致病性与其溶血能力呈平行关系。主要是耐热溶血毒素耐热溶血毒素相关溶血毒素(TDH-related hemolysin，TRH)、不耐热溶血毒素(thermolabilehemolysin，TLH)；临床上分离出的副溶血弧菌中95％都会产生直接耐热溶血毒素(TDH)，因而TDH被认为是该菌的一种主要的毒理因子。 

目前应用在副溶血弧菌的检测方法有很多，其中也有针对副溶血弧菌的TDH检测方法，目前，副溶血弧菌的检测手段主要有分离培养技术、聚合链式反应技术(Polymerase ChainReaction，PCR)、免疫学方法等。常规的分离培养操作繁琐、周期较长，检测率较低；PCR 方法虽然具有特异、敏感等特点，但其程序复杂，需要精密仪器与设备，不利于推广应用；在免疫学应用方面，应用在副溶血弧菌的方法主要有多克隆抗体检测、斑点ELISA等检测副溶血弧菌(窦勇，2006；臧红梅，2006)，都是以副溶血弧菌的菌体为抗原免疫动物得到抗血清，从而得到检测副溶血弧菌效果。这种方法也有它的局限性，具体体现在多克隆抗体受不同菌株、免疫剂量、实验动物、免疫时间、免疫血清储存时间等多种因素的影响，很难提供标准化的相关试剂，而单克隆抗体特异性强、均质性好、效果高、稳定廉价，比起多克隆抗体技术等免疫方法有明显的优越性。 

发明内容

本发明所要解决的技术问题之一在于提供一种鼠来源杂交瘤细胞系，以制备抗副溶血弧菌耐热溶血毒素单克隆抗体。 

本发明所要解决的技术问题之二在于利用上述鼠来源杂交瘤细胞系来制备的由该细胞系分泌的抗副溶血弧菌耐热溶血毒素单克隆抗体。 

本发明所要解决的技术问题之三在于上述抗副溶血弧菌耐热溶血毒素单克隆抗体的制备方法。 

作为本发明第一方面的一种杂交瘤细胞系，该杂交瘤细胞系已于2011年01月13日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏号为CGMCC No.4542，该杂交瘤细胞系的名称为T6D4，分类命名：产抗溶血弧菌耐热直接溶血毒素TDH单克隆抗体细胞株，由源于被纯化的副溶血弧菌免疫过的BalB/c小鼠的B淋巴细胞和小鼠骨髓瘤细胞SP2/0的融合而成。 

作为本发明第二方面的一种鼠抗副溶血弧菌耐热溶血毒素的单克隆抗体，由所述杂交瘤细胞系分泌而得，该单克隆抗体可与副溶血弧菌耐热溶血毒素TDH发生免疫反应，经鉴定，蛋白亚型为IgG2a。 

作为本发明第三方面的一种鼠抗副溶血弧菌耐热溶血毒素的单克隆抗体的制备方法，是首先通过提取与纯化副溶血弧菌TDH，接着免疫BalB/c小鼠，而后利用B淋巴细胞杂交瘤技术获得一株能够稳定分泌TDH单克隆抗体的杂交瘤细胞系T6D4，其用于致病性副溶血弧菌的快速检测。该抗体为一株稳定鼠源性杂交瘤细胞系所分泌的IgG_2a：能够对TDH发生特异性反应。 

所述一种鼠抗副溶血弧菌耐热溶血毒素的单克隆抗体的制备方法，具体步骤如下： 

(1)免疫抗原TDH的制备